王惋，侯俊財，于彤，姜瞻梅，田波，王玉堂，焦月華，劉飛*

1(東北農(nóng)業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱,150030) 2(東北農(nóng)業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱,150030) 3(黑龍江中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，黑龍江 哈爾濱,150040)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)廣泛存在于人類腸道中，構(gòu)成一個平衡的微生態(tài)系統(tǒng)。乳酸菌產(chǎn)生的有機酸能將食物中的蛋白質(zhì)部分降解為小分子肽和游離氨基酸，易于胃腸消化吸收，也可使鈣、磷、鐵等元素處于離子狀態(tài)，提高利用率。同時，乳酸菌及其代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素和促細胞分裂劑，對巨噬細胞的β-半乳糖苷酶活性和巨噬細胞的吞噬活性等具有顯著的激活和促進作用，能夠增強人體免疫力，并在一定程度上預(yù)防腫瘤等疾病[1]。乳酸菌對機體的免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、衰老過程和應(yīng)激反應(yīng)等發(fā)生均有重要作用[2]。乳酸菌作為一種優(yōu)質(zhì)天然抗氧化劑，其抗氧化功能備受關(guān)注。結(jié)合乳酸菌具有的保健特性和天然無毒、能貫穿食品加工過程等特點，勢必成為人們首先考慮的新型抗氧化劑[3]。細菌素是一類由乳酸菌在發(fā)酵代謝過程中產(chǎn)生的具有抑菌活性的肽類或蛋白類物質(zhì)。具有綠色無公害、無殘留和較高安全性等優(yōu)點，能夠替代食品運輸和保鮮過程中的傳統(tǒng)化學防腐劑，被公認為食品運輸和保藏技術(shù)中最具有開發(fā)和應(yīng)用前景的物質(zhì)[4]。篩選出抗氧化活性強且具有抑菌性的乳酸菌并開發(fā)成普通食品或功能食品，具有推動作用，勢必會帶來良好的經(jīng)濟效益和社會效益。

耐受胃腸道消化是外源益生菌要想在腸道中定植的必要前提，只有具備這些特性，才能在腸道中存活并發(fā)揮其益生特性[5]。本研究是將分離的乳酸菌進行耐酸性、耐膽鹽篩選，隨后對篩選出的耐脅迫能力強的菌株進行疏水性和抗氧化性能力測定，最后對供試乳酸菌進行抑菌性實驗并對篩選菌株進行鑒定。隨著微生物分類學技術(shù)的不斷進步，新的乳酸菌菌種不斷被發(fā)現(xiàn)，16S rDNA技術(shù)能體現(xiàn)不同菌屬之間的差異，又能利用測序技術(shù)較容易地得到其序列，可以作為細菌群落結(jié)構(gòu)分析最常用的系統(tǒng)進化標記分子。近年來管家基因pheS和rpoA被用來在種的水平上鑒別乳酸菌菌株，是鑒定爭議菌株的有力工具，具有快速簡便、重復(fù)性好、高區(qū)分力的特點，是檢測物種最有效的方法。本實驗旨在篩選出品質(zhì)優(yōu)良的乳酸菌菌株，為合理開發(fā)利用乳酸菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自主保藏的由傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中分離到的18株乳酸菌(A1-A18)。MRS肉湯培養(yǎng)基、鄰二氮菲、FeSO4、H2O2、DPPH自由基、K3[Fe(CN)6]、FeCl3等，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計(UV1902PC)，上海奧析科學儀器有限公司；PCR擴增儀(A600)，杭州朗基科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的耐受性及疏水性測試

1.3.1.1 耐酸性菌株篩選

參照ABOLFAZL等[6]的方法，將活化的二代菌株離心(4 ℃，4 000 r/min，10 min)，收集沉淀的菌體細胞，用pH 3.0的PBS溶液(10×0.01 mol/L)重懸，37 ℃下孵育2 h。采用平板涂布法計算乳酸菌在pH 3.0條件下0和2 h的活菌數(shù)量。

(1)

式中：A0,0 h時的單位體積活菌個數(shù)；A1,2 h時的單位體積的活菌個數(shù)。

1.3.1.2 耐膽鹽測試

參照SUCCI等[7]的方法，將完整菌體細胞用含0.30%牛膽酸鈉的PBS溶液(10×0.01 mol/L，pH 7.4)重懸，37 ℃下孵育2 h。采用平板涂布法計算乳酸菌在0.30%牛膽酸鈉中孵育0和2 h的活菌數(shù)量[7]。

(2)

式中：A0,0 h時的單位體積活菌個數(shù)；A1,2 h時的單位體積的活菌個數(shù)。

1.3.1.3 產(chǎn)酸能力試驗

將保藏菌株按體積分數(shù)2%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測pH。得到各菌株產(chǎn)酸的pH值動態(tài)變化曲線。

1.3.1.4 疏水性試驗

參照李華等[8]的方法，用PBS溶液(10×0.01 mol/L，pH 7.4)調(diào)節(jié)菌體細胞的OD600至0.8(B0)。將4 mLB0與400 μL二甲苯充分混合，旋渦振蕩3 min后，靜置30 min，分層后取水相，測定OD600 nm值。

(3)

式中：B1,最終水相的吸光度。

1.3.2 乳酸菌的抗氧化性分析

將菌體細胞用PBS溶液(10×0.01 mol/L，pH 7.4)重懸至濃度為108CFU/mL，為完整細胞懸液(intact cell，IC)。將IC用冰水浴超聲波處理10 min(超聲、間隔各5 s)，離心保留上清液，得到無細胞提取物(cell-free extract，CFE)。

1.3.2.1 羥自由基清除能力分析

參照LIU等[9]的方法測定乳酸菌羥自由基的清除能力，羥自由基清除率按公式(4)計算：

(4)

式中：Bi,樣品組吸光度；B0,無樣品無H2O2組溶液吸光度；B,無樣品組溶液吸光度。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力分析

參照劉洋等[10]的方法測定乳酸菌DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除率按公式(5)計算：

(5)

式中：Bi,樣品組吸光度;B0,蒸餾水代替樣品溶液吸光度;Bj,無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液吸光度。

1.3.2.3 還原性測定

參照LIN等[11]的方法測定乳酸菌的還原能力，測定OD700 nm值。

1.3.3 乳酸菌抑菌能力分析

采用牛津杯雙層瓊脂法[12]測定乳酸菌的抑菌能力，抑菌能力以抑菌圈直徑表示。

1.3.4 篩選乳酸菌菌株的鑒定

1.3.4.1 16S rRNA基因同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

參照張興吉等[13]的方法擴增篩選菌株的16S rRNA基因，將PCR擴增產(chǎn)物進行電泳并觀察條帶。將PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序。用Nucleotide BLAST和MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4.2 管家基因同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將菌株的管家基因苯丙氨?；鵷RNA基因(pheS)和RNA聚合酶α亞基基因(rpoA)進行擴增，擴增體系及引物序列參照SABRI等[14]的方法，退火溫度為55 ℃。將PCR產(chǎn)物送交上海生工進行測序，同源性分析后用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 統(tǒng)計分析

使用IBM SPSS Statistx 20.0(SPSS Institute Inc, U.S.A)的單因素方差分析處理數(shù)據(jù)，圖像由Origin 8.5(OriginLab Institute Inc, U.S.A.)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗脅迫能力及疏水性

2.1.1 乳酸菌酸耐受性

耐酸性結(jié)果見表1，所測試的18株乳酸菌存活率從23.7%～99.1%不等。經(jīng)耐酸耐膽鹽處理后活菌數(shù)在106CFU/mL以上就可以發(fā)揮其功能特性，可以說明存活率在75%以上的菌株具備很好的酸耐受性。其中有9株菌的存活率在75%以上，其中A15的存活率達到了97%以上。益生菌在人體胃液的條件下是否存活對其是否能夠到達腸道起著決定性作用[15]。

表1 pH 3.0條件下18株乳酸菌的存活率單位：%

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 乳酸菌膽鹽耐受性

菌株對小腸內(nèi)膽鹽耐受性是篩選乳酸菌的基本標準之一，人體小腸中膽汁鹽含量在0.03%～0.3%范圍內(nèi)波動，其耐受力的高低意味著該菌株在腸道中存活能力的高低[16]。耐膽鹽結(jié)果如表2所示，18株乳酸菌對膽鹽都具有耐受性，但是不同菌株對膽鹽的耐受性有所不同。A15在0.3%牛膽鹽環(huán)境下存活率達67.3%，膽鹽耐受性最好；而菌株A10在0.3%的膽鹽環(huán)境時的耐受性最差，存活率僅為19.1%。18株乳酸菌對膽鹽的耐受能力有所差異，這可能因為菌株對膽鹽的耐受能力與乳酸菌的膽鹽水解酶含量和自身的特性有關(guān)[7]。

表2 0.3%牛膽鹽條件下18株乳酸菌的存活率 單位：%

2.1.3 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

結(jié)合耐酸性和耐膽鹽實驗結(jié)果，篩選出菌株A1、A7、A13、A14、A15進行產(chǎn)酸能力實驗。如圖1顯示，5株乳酸菌從接種到4 h之間，pH變化很小，說明菌株的增殖緩慢，生理狀態(tài)延滯；4～14 h時期，pH值的變化加快，說明此期間細胞代謝活躍，生長速度加快，細胞繁殖力強；從第14小時開始pH值變化趨緩，菌株進入穩(wěn)定期。其中菌株A15在24 h時pH值到達最低，3.68。

圖1 乳酸菌在不同時間的產(chǎn)酸能力曲線Fig.1 Acid yield curve of lactic acid bacteria atdifferent time

2.1.4 疏水性試驗

如圖2所示，根據(jù)MATH標準[8]，除菌株A13之外，均為高疏水性。其中菌株A14疏水率高達82.0%。疏水性是影響乳酸菌黏附性的主要因素，龔虹等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，益生菌生物膜疏水能力與黏附能力呈正相關(guān)，可作為考察菌株黏附能力的指標。DEL等[18]也研究了雙歧桿菌的黏附與疏水性關(guān)系，結(jié)果表明具備高菌體表面疏水性的乳酸菌具有更高的黏附力。黏附性強的乳酸菌更容易在人體腸道中定植，在人體中發(fā)揮益生作用[19]。

圖2 5株乳酸菌的表面疏水性Fig.2 Surface hydrophobicity of five strains of lacticacid bacteria

2.2 篩選菌株的抗氧化性能力

2.2.1 對羥自由基的清除能力

如圖3所示，菌株A15完整細胞的羥自由基清除能力最強，達39.29%，且與其余3株菌的完整細胞差異顯著(P<0.05)。同一菌株中完整菌體細胞的羥自由基清除能力比無細胞提取物強的多。這與王曦等[20]的結(jié)論相同，因為完整菌體細胞中含有大量的谷胱甘肽還原酶、過氧化物酶等，能直接清除機體自由基[21]。同時，氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶會將H2O2分解成H2O和O2，從而防止羥自由基的形成[22]。正是由于這些抗氧化物質(zhì)在乳酸菌中的種類差異或同種抗氧化物質(zhì)的多少不同，導(dǎo)致不同乳酸菌的羥自由基清除能力差異顯著[23]。

圖3 乳酸菌完整細胞和無細胞提取物的羥自由基清除率Fig.3 The removal rate of hydroxyfree radical of IC andCFE of lactic acid bacteria

2.2.2 對DPPH自由基的清除能力

由圖4可知，菌株A15的IC和CFE的DPPH自由基清除能力均是最強的,并且IC組的DPPH自由基清除能力均比CFE組強,這是因為完整菌體細胞可以產(chǎn)出胞外多糖，多糖具有一定的供氫能力，通過氫原子轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，對DPPH自由基發(fā)生中和作用[24]。CHEN等[25]報道了多糖中作為電子供體的側(cè)鏈糖苷鍵中的羥基能夠結(jié)合自由基離子，自由基鏈反應(yīng)才得以終止。

圖4 乳酸菌完整細胞和無細胞提取物的DPPH·自由基清除率Fig.4 The removal rate of DPPH· free radicals of IC andCFE of lactic acid bacteria

2.2.3 乳酸菌的還原活性

由表3可知，菌株A15的還原能力最強，A7還原能力最弱。4種乳酸菌CFE的還原能力明顯弱于IC。完整菌體細胞中存在氧化還原調(diào)控系統(tǒng)，此外，半胱氨酸殘基中的巰基具有接收電子的作用，其大量存在于谷胱甘肽中，巰基能夠以氧化還原酶的輔基形式存在，從而避免氧化應(yīng)激反應(yīng)對機體造成的危害，避免蛋白等生物大分子的損傷[26]。

表3 乳酸菌完整細胞和無細胞提取物的還原能力 單位：μmol/L L-半胱氨酸

注：同一列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 乳酸菌的抑菌能力

菌株的抑菌圈直徑結(jié)果見表4，只有A15對2種指示菌均有抑制作用，而表1的結(jié)果表明菌株A15的酸耐受性最強，并且由圖1可知菌株A15具有較強的產(chǎn)酸能力，使得其對酸性環(huán)境具有最強的適應(yīng)能力。因此，菌株A15發(fā)揮抑菌作用的主要原因可能是其代謝產(chǎn)物中的各種有機酸[27]。一般來說，酸性條件會增強其抑菌物質(zhì)活躍度，提高抑菌效力。KOGA等[28]將培養(yǎng)上清液用過氧化氫酶處理，發(fā)現(xiàn)抑制區(qū)保持不變。當乳酸菌培養(yǎng)上清液的pH 6.5時，沒有觀察到抑制區(qū)。這表明乳酸菌產(chǎn)生的抗菌作用是由于有機酸的產(chǎn)生。乳酸和乙酸能夠使細胞質(zhì)酸化，阻礙細胞內(nèi)質(zhì)子的運動，從而迅速降低細胞的新陳代謝，導(dǎo)致菌體細胞的生長緩慢，最終死亡[29]。

表4 乳酸菌對2種指示菌的抑菌圈直徑 單位：mm

注：“-”表示未檢測出

2.4 乳酸菌的16S rRNA基因相似性分析結(jié)果

根據(jù)圖5中16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹可以確定4株菌中，1株為腸球菌，其余3株菌為乳桿菌。其中菌株A1與EnterococcusfaeciumLMG 11423和EnterococcuslactisBT159的16S rRNA基因序列相似性都為99.8%，通過16S rDNA序列分析的分類學地位，僅能確定菌株A1屬于腸球菌屬；菌株A7確定其為副干酪乳桿菌；由于LactobacillusplantarumJCM 1149和LactobacilluspentosusATCC8041的16S rDNA序列相似性大于99%，無法確定菌株A14和A15的分類學地位，僅能確定它們都屬于乳桿菌，需進一步的鑒定實驗才能確定其具體的分類學地位。

圖5 乳酸菌16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria basedon 16S rRNA gene sequences

2.5 篩選菌株的pheS基因和rpoA基因同源性分析結(jié)果

管家基因pheS系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果見圖6-a?？梢源_定菌株A14為植物乳桿菌，菌株A1為乳腸球菌。菌株A15與菌株Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumLMG 6907和LactobacillusarizonensisLMG 19807的pheS基因序列相似性都為100%，因此無法確定A15的分類地位。進一步采用管家基因rpoA同源性比較對其進行分析，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6-b，可以確定菌株A15是植物乳桿菌植物亞種。

植物乳桿菌和戊糖乳桿菌的16S rDNA序列相似性高達99%，通常利用傳統(tǒng)的16S rDNA分子生物學鑒定方法無法將兩者準確鑒定。OGUNTOYINBO等[30]通過利用pheS和rpoA的基因測序方法，在16S rDNA分子生物學鑒定方法的基礎(chǔ)上闡明了所分離出的植物乳桿菌與戊糖乳桿菌以及副植物乳桿菌間的密切關(guān)系。因此，本研究的鑒定結(jié)果與孟令帥等[31]的研究結(jié)果相比,更加準確完善。

3 結(jié)論

18株乳酸菌篩選得到4株耐酸、耐膽鹽效果良好、產(chǎn)酸能力強、疏水性高的乳酸菌。4株菌的完整細胞懸液抗氧化能力遠高于無細胞提取物，其中菌株A15的抗氧化能力最強。菌株A15完整細胞懸液的羥自由基和DPPH自由基清除率分別為39%和51%，菌株A14完整細胞懸液的羥自由基和DPPH自由基清除率分別為35%和50%。菌株A15和A7均可抑制大腸桿菌，此外菌株A15還對金黃色葡萄球菌有抑制作用。經(jīng)16S rRNA基因、管家基因pheS和rpoA的序列同源性分析，確定菌株A7為副干酪乳桿菌、菌株A1為乳腸球菌、菌株A14為副植物乳桿菌、菌株A15為植物乳桿菌植物亞種。本研究所篩選的益生性乳酸菌菌株為其進一步應(yīng)用于開發(fā)新型營養(yǎng)健康食品奠定了基礎(chǔ)。

a-pheS序列；b-rpoA序列圖6 乳酸菌pheS序列和rpoA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree of lactic acid bacteria based onpheS and rpoA sequences