郅 程，袁忠民，賴妙玲，廖德貴，郝卓芳，張新華

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 1.病理科，2.神經(jīng)科學(xué)研究所，3.口腔科，廣東 廣州 510260）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是發(fā)生于口腔的惡性腫瘤，是世界上最常見的惡性腫瘤之一，約占口腔惡性腫瘤的90%［1］。到目前為止，口腔的惡性腫瘤在亞洲國(guó)家普遍存在，發(fā)病率仍在上升。OSCC具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)和局部轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，高復(fù)發(fā)率，預(yù)后差，常在晚期才被診斷［2-3］。雖然手術(shù)切除聯(lián)合放療、新輔助化療、靶向生物治療等在診斷和臨床治療方面取得了巨大進(jìn)展，但總體OSCC患者生存率仍略有提高，3年生存率為50%～75%，5年生存率約為50%［4］。因此，為提高OSCC患者的預(yù)后和生存率，尋找合適的預(yù)后或轉(zhuǎn)移性生物標(biāo)志物和治療策略勢(shì)在必行。Tip60（KAT5）屬于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）的MYST家族。在許多細(xì)胞事件中發(fā)揮作用，包括染色質(zhì)重構(gòu)、DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄、凋亡和腫瘤發(fā)生［5］。Tip60（KAT5）在腫瘤發(fā)生中起著重要的作用［6-12］。在OSCC組織中，是否存在Tip60（KAT5）表達(dá)不同而促進(jìn)或抑制腫瘤發(fā)生和發(fā)展，尚未見報(bào)道。本研究通過采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)OSCC中Tip60（KAT5）蛋白的表達(dá)情況，分析其與患者臨床特征之間的關(guān)系，并通過MTT技術(shù)檢測(cè)Tip60（KAT5）抑制劑Nu9056對(duì)OSCC細(xì)胞株Cal27及UM1細(xì)胞凋亡的影響，從而為進(jìn)一步探討Tip60（KAT5）在OSCC中的調(diào)控作用和分子機(jī)制做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材 料

收集2015年4月至2018年12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的口腔鱗狀細(xì)胞癌石蠟包埋標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放療或化療，均知情同意。樣本情況如下：高分化鱗狀細(xì)胞癌30例、中分化鱗狀細(xì)胞癌7例、低分化鱗狀細(xì)胞癌12例及36例口腔鱗狀細(xì)胞癌癌旁正常組織，鱗狀細(xì)胞癌組織學(xué)分化程度依據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的《病理學(xué)》［13］。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)審核批準(zhǔn)。鱗狀細(xì)胞癌的臨床病理特征見表1。

人口腔鱗癌細(xì)胞株Cal27及UM1購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)于Gbico公司。培養(yǎng)基高糖DMEM購(gòu)于Invitrogen。Tip60（KAT5）抑制劑Nu9056購(gòu)自Selleck。Anti-Tip60（clone 3F9）購(gòu)于GeneTex。

1.2 方 法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 所有石蠟包埋病理標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。采用Envision法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片厚度為4 μm，經(jīng)脫蠟水化；Tris-EDTA修復(fù)液高壓修復(fù)；3%H2O210 min，阻斷過氧化物酶；PBS沖洗，滴加一抗Tip60（KAT5）（GeneTex，3F9），放入37℃水浴箱孵育60 min；PBS沖洗后按照采用Envision檢測(cè)試劑盒（DAKO公司）說明書進(jìn)行，室溫孵育30 min；再次PBS沖洗，DAB顯色；蘇木精復(fù)染，然后脫水、透明、封片。按照抗體說明書分別用膀胱組織及肺癌組織作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每例均設(shè)陽性對(duì)照及陰性對(duì)照。

免疫組化結(jié)果半定量判定：染色程度為基本不著色為0分；著色呈淡黃色為1分；著色呈黃色為2分；著色呈棕褐色為3分。染色陽性細(xì)胞百分比計(jì)數(shù)，計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞占總腫瘤細(xì)胞的比例，將其分為5個(gè)等級(jí)：著色陽性細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞≤5%為0分（-），6%～25%為1分（+），26%～50%為2分（++），51%～75%為3分（+++），≥76%為4分（++++）。將染色程度分級(jí)與染色細(xì)胞百分比相乘，乘積=0為陰性，乘積≤4分為低表達(dá)，5≤乘積≤8分為中表達(dá)，9≤乘積≤12分為高表達(dá)［14］。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Cal27及Um1置于體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、高糖DMEM液體培養(yǎng)液，37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3～5 d用胰酶消化傳代1次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT比色法檢測(cè)Tip60（KAT）抑制劑Nu9056對(duì)Cal27及Um1細(xì)胞增殖的影響 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，鋪96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μL細(xì)懸液；體積分?jǐn)?shù)5%CO2，37 ℃孵育24 h后，換含有溶劑、不同濃度Nu9056（5、10及20 μmol/L）的培養(yǎng)基，作用24 h或換含有溶劑、Nu9056（5 μmol/L及10 μmol/L）的培養(yǎng)基，每組在培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490 nm處測(cè)量各孔的吸光值。計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率=（各加藥組OD值-空白組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%，加入DMSO作為溶劑對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。多組間Tip60（KAT5）表達(dá)率的比較用多個(gè)樣本率的χ2檢驗(yàn)。Cal27及UM1細(xì)胞各組MTT檢測(cè)數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本間比較采用單因素方差分析one-way ANOVA；隨后的組間比較采用LSD法。相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tip60（KAT5）在口腔鱗狀細(xì)胞癌及癌旁正常組織中的表達(dá)

Tip60（KAT5）陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)見棕黃色顆粒（圖1A～H）。36例口腔鱗狀細(xì)胞癌及其癌旁正常組織中，鱗狀細(xì)胞癌Tip60（KAT5）高表達(dá)率66.67%，癌旁正常組織Tip60（KAT5）高表達(dá)率8.33%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=58.062，P=0.000；表1，圖1I）。

表1 OSCC及癌旁正常組織中Tip60（KAT5）表達(dá)情況Table 1 Tip60/KAT5 expression in OSCC and normal tissue adjacent to OSCC（n）

2.2 Tip60（KAT5）表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同分化程度OSCC及癌旁正常組織中Tip60（KAT5）的表達(dá)Fig.1 Tip60（KAT5）expression in OSCC and normal tissue adjacent to OSCC was detected by immunohistochemical analysis

Tip60（KAT5）表達(dá)與患者腫瘤分化程度相關(guān)。與高分化鱗狀細(xì)胞癌相比，中-低分化鱗狀細(xì)胞癌中Tip60（KAT5）的表達(dá)明顯增高（χ2=10.432，P=0.001；圖1J，表2）；隨著組織學(xué)級(jí)別的升高，Tip60（KAT5）的表達(dá)增高，其表達(dá)強(qiáng)度與組織學(xué)級(jí)別呈明顯正相關(guān)（r=0.461，P=0.001）。Tip60（KAT5）在不同年齡組間、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)（表2）。

2.3 Tip60（KAT5）抑 制劑Nu9056對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞株增殖的影響

MTT方法檢測(cè)抑制劑Nu9056在不同濃度（DMSO、5、10及20 μmol/L）及不同時(shí)間（24、48及72 h）作用情況下對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞株增殖的抑制作用，結(jié)果顯示隨著濃度及時(shí)間的增加，對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加，呈濃度及時(shí)間依賴關(guān)系。不同濃度及時(shí)間之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（不同濃度對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞的增殖抑制率比較F=322.13，P=0.000；F=252.76，P=0.000；5 μmol/L及10 μmol/L作用不同時(shí)間對(duì)Cal27細(xì)胞的增殖抑制率比較F=231.29，P=0.000；F=817.85，P=0.000；5 μmol/L及10 μmol/L作用不同時(shí)間對(duì)UM1細(xì)胞的增殖抑制率比較：F=243.40，P=0.000；F=1222.47，P=0.000；圖2）。

3 討論

真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)通過翻譯后修飾使其發(fā)生活性或功能改變，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、信息傳遞及對(duì)環(huán)境因素刺激的應(yīng)答反應(yīng)。其中，賴氨酸乙酰化是改變蛋白質(zhì)功能最普遍的一種修飾方式之一，可以影響蛋白的酶活性、穩(wěn)定性、DNA結(jié)合能力及蛋白質(zhì)之間的相互作用等［15］。乙?；揎椨山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）共同調(diào)控，其中Tip60（也稱為KAT5）屬于組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，HAT）的MYST家族，依靠其具有的乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，乙?；M蛋白，中和組蛋白上的正電荷，從而降低其與帶負(fù)電荷的DNA的結(jié)合親和力，從而降低了組蛋白與染色體的親和力［16-17］。同時(shí)，Tip60可以乙?；渌c轉(zhuǎn)錄因子及DNA損傷反應(yīng)相關(guān)蛋白，如Myc、STAT3、NF-B、E2F1、ATM和p53［18-21］。因此Tip60通過多種方式影響腫瘤發(fā)生，Tip60的低表達(dá)或表達(dá)缺失與在晚期結(jié)直腸癌［6-7］、胃癌［8］和乳腺癌［9-10］的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，敲除Tip60可促進(jìn)黑色素瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的遷移和侵襲［11-12］。然而，在前列腺癌中卻恰恰相反，Tip60抑制劑Nu9056可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡［22］。

表2 49例口腔癌組織中Tip60蛋白表達(dá)與腫瘤患者臨床特征的關(guān)系Table 2 Tip60（KAT5）expression and Clinic pathological feature of 49 OSCC（n）

圖2 MTT法檢測(cè)Nu9056對(duì)Cal27及UM1細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.2 Inhibition rate of proliferation of Cal27 and UM1 cells by Tip60（KAT5）inhibitor Nu9056

本研究基于免疫組織化學(xué)的方法，首先探討了OSCC中Tip60的表達(dá)情況，與正常組織相比，OSCC中Tip60的表達(dá)明顯升高，其高表達(dá)率為66.7%，且與分化程度呈正相關(guān)，而與直腸癌、胃癌和乳腺癌表達(dá)略有不同［7-11］，可能與腫瘤部位及類型有關(guān)，同時(shí)我們研究發(fā)現(xiàn)Tip60抑制劑Nu9056可降低OSCC細(xì)胞增殖活性，這一點(diǎn)與前列腺癌研究結(jié)果相一致。因此，我們可以得出結(jié)論，Tip60蛋白上調(diào)與OSCC的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)，并且通過抑制Tip60的表達(dá)可阻礙OSCC的發(fā)展。

以順鉑為代表的鉑類化合物由于其顯著的抗瘤效應(yīng)，是治療口腔鱗狀細(xì)胞癌最常用的一類化療藥物，然而臨床上越來越多的病人對(duì)順鉑產(chǎn)生的耐藥性。Su及Cregan等團(tuán)隊(duì)都發(fā)現(xiàn)降低Tip60的表達(dá)可以增加細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性［23-24］。順鉑通過與DNA形成復(fù)合體，導(dǎo)致DNA的大量扭曲、雙螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，從而抑制DNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡。Tip60可以降低DNA修復(fù)活性，導(dǎo)致順鉑與DNA復(fù)合物增加，從而降低順鉑的耐藥性。因此，Tip60及其相關(guān)抑制劑為OSCC的鉑類化合物化療尋找新的靶點(diǎn)。