代新珍，米賢軍，鐘守軍，段立鋒，楊偉洪，劉祥玉，徐秀梅，黃兆華

（中山市博愛醫(yī)院病理科，廣東中山 528403）

乳腺癌是女性最常見的腫瘤之一，也是世界上女性死亡的常見原因，其發(fā)病年齡越來越年輕，因此乳腺癌仍是威脅女性健康的最常見惡性腫瘤之一，乳腺癌的早期篩查、診斷、判斷預(yù)后、個性化治療仍是目前的研究重點。目前研究表明乳腺癌的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與分子生物學(xué)存在一定的相關(guān)性［1］。超聲檢查目前已經(jīng)普遍應(yīng)用于乳腺癌的早期篩查及診斷中，現(xiàn)在越來越多的研究證實乳腺癌超聲檢查與分子免疫組化之間存在著一定的相關(guān)性，通過觀察乳腺癌的超聲征象可以預(yù)測不同分子免疫組化的表達情況及判斷預(yù)后［2］。乳腺癌是多種基因相互協(xié)調(diào)作用下發(fā)生的，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，越來越多的生物標志物被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中起著作用。Runx2是一種樹突狀細胞基因疫苗，在三陰性乳腺癌組織中起著一定的作用，但具體機制尚不清楚，而FosB做為AP家族成員之一，參與乳腺癌的治療相關(guān)機制，可以導(dǎo)致TNBC細胞的死亡，TP4和黃嘌呤類藥物等通過促進FosB的表達起到殺傷TNBC腫瘤細胞［3-5］，提示FosB可能在乳腺癌治療起著作用。然而目前國內(nèi)外研究對于FosB在浸潤性乳腺癌的表達情況及作用機制尚未見報道。本研究通過聯(lián)合超聲檢測乳腺癌患者的超聲征象及免疫組織化學(xué)方法（SP法）檢測FosB在浸潤性乳腺癌組織中的表達，分析FosB的表達差異與超聲征象、組織學(xué)分級、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕酮受體（pro?gesterone receptor，PR）等臨床因素之間的相關(guān)性，期望為浸潤性乳腺癌個性化靶向治療及乳腺癌的鑒別診斷、預(yù)后判斷提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

選取2013年3月至2019年3月于我院手術(shù)切除后經(jīng)我科病理醫(yī)生證實的155例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌，36例癌旁組織及30例正常乳腺組織作為對照。乳腺癌患者中位年齡49（28～83）歲；TNM分期Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ期分別有43、112例；組織學(xué)分級Ⅰ-Ⅱ、Ⅲ級分別有107和48例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移74例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移81例；乳腺癌患者中術(shù)后標本腫物直徑≤2 cm的76例，腫物直徑＞2 cm的79例。所有患者術(shù)前均行超聲檢查，術(shù)后行相關(guān)免疫組化檢查?；颊呔鞘状巫≡盒心[塊切除術(shù)，排除術(shù)前放療、化療及內(nèi)分泌治療患者，術(shù)前臨床資料完整。所有患者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)本單位倫理委員會審核同意免倫理審批。

1.2 試 劑

兔單克隆抗體FosB購自abcam及SP試劑盒購自羅氏公司。

1.3 免疫組化SP方法及結(jié)果判讀

所有乳腺組織標本均常規(guī)石蠟包埋，采用SP法染色對FosB、ER、PR、人表皮生長因子受體-2（human epithelial growth factor receptor-2，Her2）等蛋白進行檢測，實驗步驟嚴格按照試劑說明書進行。ER、PR、Her2免疫組化結(jié)果根據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會標準進行判斷，ER、PR棕褐色染色細胞數(shù)＞1%為陽性；Her2表達于細胞膜，Her2 FISH檢測結(jié)果陽性及Her2免疫組織化學(xué)結(jié)果為3+的判定為Her2陽性，其他為陰性。FosB工作濃度為1：200，定位于細胞核，判斷方法為在鏡下觀察，根據(jù)棕色反應(yīng)的陽性強度及面積判斷結(jié)果。采用二級積分法：陽性細胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；染色強度淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕褐色或黑色為3分；最后計算兩者得分相乘，結(jié)果得分大致分布在0～4分與6～12分區(qū)間，故本實驗以兩者得分相乘≥6分判讀為陽性。閱片采用雙盲法讀片。

1.4 熒光原位雜交技術(shù)

所有Her2免疫組織化學(xué)結(jié)果為2+的病理組織都進行Her2熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測，Her2基因擴增檢測試劑盒及原位雜交儀ThermoBrite均由廣州安必平公司提供，熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品。

1.5 B超儀器及相關(guān)方法

超聲檢查使用西門子S3000和日立圖騰彩色多普勒超聲儀，探頭頻率8～12 MHz。患者行乳腺超聲檢查，報告描述腫塊大小、縱橫比、邊界、形態(tài)、微鈣化、彩色血流、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、后方回聲衰減等。數(shù)據(jù)資料均通過超聲工作站記錄進行回顧性分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

全部統(tǒng)計分析用SPSS 19.0完成。兩組樣本間為分類資料，表1理論數(shù)字均大于5，故均采用四格表卡方檢驗；表2除了縱橫比理論數(shù)據(jù)小于5采用四格表確切概率法外，其他理論數(shù)據(jù)均大于5，采用四格表卡方檢驗。P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FosB在乳腺組織中的表達

FosB在乳腺組織的表達定位于細胞核，免疫組化染色差異主要在于染色強度及范圍的不同（圖1）。FosB在正常乳腺組織中染色一般為棕褐色或黑色，染色范圍大于50%，在乳腺癌中的染色范圍從0到大于75%，染色強度也從無到棕褐色（0～3分）；乳腺部分間質(zhì)細胞中也可見少許染色為棕褐色。155例浸潤性乳腺癌組織中FosB陽性表達率為23.2%（36/155），36例乳腺癌旁組織中FosB陽性表達率為86.1%（31/36），30例乳腺正常組織中FosB陽性表達率為86.7%（26/30），F(xiàn)osB在浸潤性導(dǎo)管癌的表達水平明顯低于癌旁組織及正常乳腺組織中的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000，表1）。

2.2 FosB的表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

FosB在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的陽性表達率為23.2%（36/155），在ER陽性與陰性之間（陽性表達率分別是29.2%、7.1%，P=0.004），在PR陽性與陰性之間（陽性表達率分別是33.7%、6.7%，P=0.000），在組織學(xué)Ⅰ-Ⅱ級與Ⅲ級之間（陽性表達率分別是28.0%、12.5%，P=0.034），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；在腫瘤直徑≤2 cm與＞2 cm之間（陽性表達率分別是21.1%、25.3%，P=0.530），在患者年齡≤50歲與＞50歲之間（陽性表達率分別是23.2%、23.2%，P=0.998），在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與無轉(zhuǎn)移之間（陽性表達率分別是27.0%、19.8%，P=0.284），腫瘤TNM分期中Ⅰ期與Ⅱ-Ⅲ期之間（陽性表達率分別是18.6%、25.0%，P=0.399，在Her2陽性與陰性之間（陽性表達率分別是15.9%、26.1%，P=0.174），差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05；表1）。

圖1 FosB在不同的乳腺組織中有代表性的染色情況Fig.1 Representative immunohistochemicai staining of FosB in different breast tissues

表1 FosB蛋白在不同的乳腺組織中的表達情況及與臨床病理指標的關(guān)系Table 1 The expression of FosB in different breast tissues and its clinical significance［n（%）］

2.3 FosB在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中的表達與超聲征象關(guān)系

浸潤性乳腺癌組織中FosB的表達在不同超聲征象組：腫塊大小、縱橫比、形態(tài)、邊界、后方回聲衰減及彩色血流之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；FosB在超聲顯示存在微鈣化或腋窩淋巴結(jié)增大的浸潤性乳腺癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 FosB在乳腺癌組織中的表達與超聲征象的相關(guān)性Table 2 The expression of FosB in breast cancer is correlated with ultrasonographic features［n（%）］

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病年齡越來越年輕化，嚴重威脅了女性生命和影響了女性生活質(zhì)量。雖然目前手術(shù)加上化療幫助很大一部分患者減輕癥狀，提高了患者生存率，但效果都不是很滿意，仍然有一部分患者死于乳腺癌。因此，尋找新的治療方法和預(yù)后指標仍然是乳腺癌目前研究的熱點問題。乳腺癌的發(fā)病的相關(guān)分子機制尚未明確，其發(fā)生、發(fā)展是一系列基因漸進性累積過程，隨著分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，越來越多的生物標志物被發(fā)現(xiàn)，為其預(yù)后判斷、治療方案的選擇提供了更全面的依據(jù)。

近年來隨著對AP-1家族成員研究的深入，發(fā)現(xiàn)其參與多種腫瘤的發(fā)生、凋亡和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程。而FosB［6-7］作為AP-1家族成員中重要的一員，F(xiàn)osB參與腫瘤的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中充當重要角色。國外目前研究比較多的是FosB在神經(jīng)元細胞及大腦組織中的作用［8］，有研究［9-12］也發(fā)現(xiàn)FosB在間充質(zhì)細胞增生、骨組織分化、肺癌、卵巢癌以及胃癌中均發(fā)揮著重要作用。Hung等［13］則發(fā)現(xiàn)在假肌源性血管內(nèi)皮瘤，F(xiàn)osB還可以做為一個診斷指標，有助于與其他上皮樣肉瘤及血管腫瘤的鑒別診斷。以上文獻顯示FosB通過各種調(diào)控機制在各種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，然而目前國內(nèi)外對于FosB在浸潤性乳腺癌中的表達及相關(guān)作用研究比較少見。有研究［14-15］通過蛋白質(zhì)交互作用和基因交互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測到FosB在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。Gao等［16］則認為FosB做為AP家族成員中的一員，在乳腺癌組織分化等中起著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過免疫組化檢測FosB在浸潤性乳腺癌、癌旁組織及正常乳腺組織中的表達，發(fā)現(xiàn)在浸潤性乳腺癌中FosB的表達水平明顯低于癌旁組織及正常乳腺組織中（陽性表達率分別是23.2%、86.1%、86.7%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示FosB有助于維持乳腺組織正常生長，F(xiàn)osB表達缺失促進腫瘤的發(fā)生。Li等［17］發(fā)現(xiàn)FosB在乳腺癌組織中的表達明顯低于在血液中的表達；Milde-Langosch等［18］則提出FosB是乳腺上皮細胞正常增殖和分化所必須的，F(xiàn)osB表達降低可以使乳腺上皮去分化而導(dǎo)致乳腺腫瘤的產(chǎn)生，上述結(jié)果與這些文獻報道是一致的。本研究通過免疫組化檢測FosB在浸潤性乳腺癌不同分化組織中的表達水平，也發(fā)現(xiàn)了FosB在浸潤性乳腺癌組織學(xué)Ⅰ-Ⅱ級（高-中分化）中的陽性表達水平明顯高于組織學(xué)Ⅲ級組（低分化），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示了FosB的表達與腫瘤惡性程度有關(guān)，隨著惡性等級增高，其陽性率逐漸降低，乳腺癌組織中FosB高表達的細胞分化往往較好，惡性程度低，預(yù)后較好，F(xiàn)osB低表達的細胞分化較差，惡性程度較高，預(yù)后差，這些結(jié)果與Milde-Lan?gosch等［18］提出的FosB在分化差的浸潤性乳腺癌的表達水平較低的觀點是一致的。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)FosB在浸潤性乳腺癌ER+、PR+組織中的表達水平明顯高于ER-、PR-組織中（陽性表達率分別是29.2%、33.7%與7.1%、6.7%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示FosB在浸潤性乳腺癌中的表達水平與ER、PR陽性正相關(guān)，Bamberger等［19-20］研究發(fā)現(xiàn)FosB在乳腺癌細胞中的表達與雌激素受體即ER的表達正相關(guān)；Bamberger等［21］提出FosB在乳腺癌組織中的表達水平與PR的兩種亞型PR-A和PR-B密切正相關(guān)，特別是與PR-B的表達水平，這些文獻報道與本研究結(jié)果是一致的。有研究［3-5］提出FosB導(dǎo)致TNBC細胞的死亡，TP4、蒽環(huán)類藥物等通過促進FosB的表達起到殺傷TNBC腫瘤細胞，F(xiàn)osB參與乳腺癌治療過程，而本研究發(fā)現(xiàn)FosB在浸潤性乳腺癌ER/PR陽性的患者中高表達，有望為這類患者個性化治療提供新的研究方向。本研究的其他結(jié)果發(fā)現(xiàn)FosB在乳腺癌中的表達與腫物直徑大小、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER2及臨床分期無關(guān)，目前國內(nèi)外對FosB這些方面的作用尚未見明確報道。

Jin等［22］認為serpinB在乳腺癌中起著促進腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，降低生存率的作用，而在三陰性型乳腺癌細胞系MDA-MB-231細胞中FosB可以負向調(diào)控serpinB的表達，預(yù)測FosB可能可以通過抑制serpinB的表達進而抑制三陰性型乳腺癌的轉(zhuǎn)移，并提高患者生存率，本研究結(jié)果提示FosB的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期無明顯相關(guān)，與文獻預(yù)測存在一些差異。這些差異可能與FosB一大特點有關(guān)即為FosB是Fos家族成員之一，而在體內(nèi)Fos家族成員只能和Jun家族成員形成異二聚體；進而激活或抑制多種靶基因的表達，調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡，F(xiàn)os家族和Jun家族成員中的各個基因作用不一致，例如JunD可以通過激活乳腺癌標志物LY6K的表達進而促進乳腺癌轉(zhuǎn)移，降低生存率［23］，與FosB的作用相反，故在乳腺癌患者體內(nèi)存在的這些蛋白之間交互作用最終導(dǎo)致的結(jié)果和體外細胞系中FosB單獨作用的結(jié)果不一致。并且Kong等［23］的研究是在體外細胞系MDA-MB-231中進行預(yù)測的，并未直接檢測FosB對乳腺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存率的影響，也未對其他亞型細胞系中FosB的作用進行預(yù)測，故文獻報道暫時具有局限性。目前關(guān)于FosB在浸潤性乳腺癌患者中對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者生存率的影響及相關(guān)作用機制有待后期進一步研究。

超聲檢查目前已經(jīng)普遍應(yīng)用于乳腺癌的診斷中，而分子免疫組化指標是決定乳腺癌病理形態(tài)學(xué)改變的重要因素之一，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，越來越多的分子免疫組化指標被發(fā)現(xiàn)與乳腺癌形態(tài)學(xué)改變密切相關(guān)，因而利用超聲診斷技術(shù)可以預(yù)測乳腺癌組織中某些分子免疫組化指標的表達，對在臨床中預(yù)測預(yù)后、指導(dǎo)治療方案等方面起著重要作用。本研究通過回顧性分析乳腺癌超聲征象及免疫組化檢測FosB在乳腺癌患者中的表達，分析其相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FosB的表達與腫塊大小、縱橫比、形態(tài)、邊界、后方回聲衰減及彩色血流之間無統(tǒng)計學(xué)差異；FosB在超聲顯示存在微鈣化或腋窩淋巴結(jié)增大的浸潤性乳腺癌組織中高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。本研究這一結(jié)果表明了在術(shù)前超聲顯示微鈣化多的乳腺癌患者意味著FosB高表達，而本研究上述免疫組化結(jié)果已表明FosB的表達與ER、PR正相關(guān)，故術(shù)前超聲顯示微鈣化提示著FosB、ER、PR的高表達，這一結(jié)果與孟令玉等［24］提到的微鈣化在Luminal A型（ER/PR強表達）組織中多見是一致的。FosB在超聲顯示腋窩淋巴結(jié)增大的浸潤性乳腺癌組織中高表達，與免疫組化檢測顯示FosB在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中高表達結(jié)果不一致，可能是因為超聲顯示的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移僅僅是從淋巴結(jié)大小來說的，并不都是發(fā)生了癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，僅僅是提示轉(zhuǎn)移的可能性，故對手術(shù)后病理結(jié)果顯示有癌轉(zhuǎn)移的組織進行免疫組化檢測FosB的表達更能代表FosB在乳腺癌中的作用，F(xiàn)osB在乳腺癌淋巴結(jié)組織中低表達是預(yù)后較好的指標。聯(lián)合超聲與FosB能夠更加明確的判讀浸潤性乳腺癌的惡性程度。乳癌超聲特征與FosB的表達具有相關(guān)性，兩者結(jié)合對于判斷浸潤性乳腺癌的惡性程度及預(yù)后更有價值。

綜上所述，F(xiàn)osB在乳腺癌中的陽性表達率為23.2%，明顯低于癌旁組織及正常乳腺組織，聯(lián)合檢測FosB在乳腺組織中的表達情況，有利于乳腺癌的鑒別診斷。FosB在乳腺癌組織中的差異表達與ER、PR密切相關(guān)，有望為ER、PR高表達的患者個性化治療研究提供一定的方向。FosB在乳腺癌組織中的差異表達還與組織學(xué)分級、微鈣化、腋窩淋巴結(jié)存在一定的相關(guān)性，聯(lián)合超聲與FosB能夠更加明確的判讀浸潤性乳腺癌的惡性程度。

本研究衷心感謝陳昂副主任醫(yī)師審核統(tǒng)計方法；衷心感謝陳志強副主任技師幫忙指導(dǎo)切片及染色。