顏志超，游秀華，鄧彩彬

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科，廣東廣州 510260；2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006；3.中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510060）

青光眼是世界上第一位不可逆致盲眼病［1］，雖然青光眼的治療手段有很多，但降低眼內(nèi)壓是目前最明確的治療手段［1-3］。多數(shù)患者早期可以通過藥物控制眼壓，但到了后期仍然需要接受手術(shù)降眼壓治療［1，4］。濾過性手術(shù)是目前治療青光眼最常用的手術(shù)方式［4-5］，然而濾過泡瘢痕化則是導(dǎo)致手術(shù)失敗的主要原因［6］，因此抗濾過泡瘢痕化已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。盡管目前應(yīng)用于濾過區(qū)抗瘢痕形成的藥物很多，例如絲裂霉素C（mito?mycin C，MMC）［6-7］和5-氟尿嘧啶（5-FU）［6，8］，但是，這些藥物的應(yīng)用可能導(dǎo)致術(shù)后持續(xù)性低眼壓、角膜上皮損傷、眼內(nèi)炎、濾過泡滲漏、白內(nèi)障［2，9-14］等諸多并發(fā)癥的發(fā)生，且遠(yuǎn)期效果不理想。因此，尋找一種安全、有效、低毒、作用持久的藥物一直是青光眼研究領(lǐng)域的重要課題之一。雷帕霉素（rapamycin，RAPA）又稱西羅莫司（sirolimus），是從吸水性鏈霉素發(fā)酵液中提取的三烯大環(huán)內(nèi)酯類抗排斥藥物，是目前最新的強(qiáng)效免疫抑制劑之一［15-16］，具有低毒、高效的特性［17］，臨床上已用于自身免疫性疾病和器官移植后抗排斥反應(yīng)的治療［16-18］。有研究［19］表明，RAPA對(duì)人Tenon′s囊成纖維細(xì)胞的有較強(qiáng)的抑制作用，因此它極有可能成為理想的抗瘢痕增殖的新藥。根據(jù)青光眼濾過術(shù)后傷口的愈合過程可知，術(shù)后2周內(nèi)為成纖維細(xì)胞增生最活躍的時(shí)期［19］，由此我們?cè)O(shè)計(jì)以具有良好生物相容性的PLGA作為載體，制備RAPA藥物緩釋膜，擬在術(shù)中置入手術(shù)區(qū)域的Tenon′s囊下，使RAPA能夠持續(xù)穩(wěn)定地釋放，在局部達(dá)到一定的有效濃度，從而控制術(shù)后成纖維細(xì)胞的增殖達(dá)15 d之久。因此，本研究通過研制RAPA眼用緩釋膜，并對(duì)該緩釋膜的藥物含量進(jìn)行測(cè)定及體外釋放進(jìn)行驗(yàn)證研究。

1 材料與方法

1.1 RAPA眼用緩釋膜的制備

用精密分析天平（925M-202A-DRSCS PRE?CISA）稱取聚乙二醇-4000（PEG-4000，化學(xué)純，廣東汕頭市西隴化工廠）36 mg于5 mL離心管中，加入1.5 mL二氯甲烷，用渦旋混合器（Scientific industries Vortexgenie2）渦旋溶解。

稱取PLGA 50：50 poly（DL-Lactide-co-Gly?colide，特性粘度0.55～0.75 dL/g，Durect Corpora?tion Birmingham）42 mg，PLGA 50：50 poly（DLLactide-co-Glycolide，特性粘度0.17 dL/g，Durect Corporation Birmingham）15.6 mg，RAPA 14 mg于2 mL離心管中，加入1.1.1中溶液600 μL，渦旋溶解10 min，靜置5 min，將制得的溶液均勻滴加到載玻片中，置于通風(fēng)櫥中3 d，待溶劑揮干，脫膜。將制得的膜片裁剪成2.5 mm×2.5 mm小片（圖1），即得。

1.2 緩釋膜中RAPA含量測(cè)定方法學(xué)的建立

1.2.1 色譜條件 使用高效液相色譜儀（Agilent 1200美國(guó)）和色譜柱GraceSMart RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相設(shè)置為：甲醇∶水為80∶20，檢測(cè)波長(zhǎng)為278 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為45 ℃。

1.2.2 RAPA標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用精密稱取RAPA固體粉末（090901LP，純度99.5%，杭州中美華東制藥有限公司）10.2 mg于10 mL容量瓶中，用適量無(wú)水乙醇溶解，并定容至刻度，即得濃度為1.02 mg/mL RAPA無(wú)水乙醇溶液。

取1.02 mg/mL RAPA標(biāo)準(zhǔn)液2 mL，于25 mL棕色容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)0.3%十二烷基硫酸鈉（SDS，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠）溶液定容至刻度，即得濃度為81.6 μg/mL RAPA儲(chǔ)備液。

分別取RAPA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5、2.5、1.25 mL，和625、250、125、50 μL于10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)0.3% SDS溶液定容至刻度，即得濃度為40.8、20.4、10.20、5.1、2.04、1.02和0.408 μg/mL RAPA標(biāo)準(zhǔn)液。注意避光操作。取上述標(biāo)準(zhǔn)液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)RAPA濃度進(jìn)行線性回歸。

1.2.3 專屬性考察 取PLGA空白膜，加入0.5 mL乙腈溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，考察輔料對(duì)RAPA含量測(cè)定是否存在干擾。

1.2.4 回收率及精密度測(cè)定 取PLGA空白膜9片，于2 mL離心管中，分高、中、低3組，每組平行3份。高、中、低組分別加入RAPA 61.2、122.4和183.6 μg，加入乙腈至0.5 mL渦旋溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，按1.2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，同時(shí)取濃度與樣品濃度接近的RAPA標(biāo)準(zhǔn)液10 μL注入色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算回收率。

1.2.5 緩釋膜中RAPA含量測(cè)定 取RAPA緩釋眼膜6片于2 mL離心管中，加入0.5 mL乙腈渦旋溶解，取0.25 mL于10 mL容量瓶中，加0.3% SDS溶液定容至刻度，過濾，取樣品10 μL注入色譜儀進(jìn)樣分析，記錄色譜圖及峰面積，同時(shí)取濃度與樣品濃度接近的RAPA標(biāo)準(zhǔn)液10 μL注入色譜儀，按外標(biāo)法計(jì)算膜片中RAPA含量。

1.2.6 RAPA穩(wěn)定性測(cè)定 分別于0、1、5、10和15 d進(jìn)樣測(cè)定，考察RAPA在0.3% SDS溶液中的穩(wěn)定性。

1.3 RAPA眼用緩釋膜體外釋放考察

1.3.1 RAPA在不同溶劑中的溶解度考察 取過量的RAPA固體粉末，分別加入2 mL體積分?jǐn)?shù)0.1%、0.5%失水山梨醇單油酸酯聚氧乙烯醚（Tween-80，化學(xué)純，天津市百世化工有限公司）及體積分?jǐn)?shù)20%乙醇、30%乙醇、0.3%SDS渦旋溶解5 min，再放入37 ℃水浴恒溫振蕩器（SHA-B江蘇省金壇市宏華儀器廠）中，以100 r/min（r=25 mm）振搖48 h，離心取上清液，稀釋，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

1.3.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放 取RAPA眼膜1片 于20 mL西林瓶中，加 入0.3% SDS溶液10 mL，封口，置于37 ℃的水浴恒溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速100 r/min（r=25 mm），分別于第0、1、2、3、5、8、11和15 d取出樣品0.5 mL，再加入新鮮介質(zhì)0.5 mL。樣品液過濾，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，平行測(cè)定3份。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)值變量符合正態(tài)分布以（）描述，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)和四分位數(shù)間距描述，分類變量以例數(shù)（n）及其百分比（%）描述。RAPA濃度與峰面積的關(guān)系采用簡(jiǎn)單線性回歸，R2＞0.99提示呈良好的線性關(guān)系。RAPA在不同溶劑中的溶解度考察以及RAPA眼用緩釋膜體外釋放結(jié)果比較，不同組別之間數(shù)值變量比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的兩兩比較使用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 RAPA緩釋膜的特性及RAPA含量測(cè)定

2.1.1 RAPA標(biāo)準(zhǔn)曲線 經(jīng)線性回歸得出RAPA標(biāo)準(zhǔn)曲線。可知RAPA濃度在0.408～40.8 μg/mL范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（圖2）。

2.1.2 專屬性考察 藥膜中輔料及0.3% SDS溶液對(duì)RAPA含量測(cè)定沒有干擾，含量測(cè)定專屬性好（圖3）。

2.1.3 回收率及精密度測(cè)定 高濃度藥物含量組的回收率為100.34%～105.43%，平均回收率為103.35%，精密度為2.58%；中濃度藥物含量組的回收率為98.08%～103.32%，平均回收率為101.47%，精密度為2.90%；低濃度藥物含量組的回收率為101.69%～106.01%，平均回收率為103.67%，精密度為2.41%（表1）。

2.1.4 緩釋膜中RAPA含量測(cè)定結(jié)果 緩釋膜中RAPA的含量在98.68～125.34 μg之間，平均含量為（112.6±10.1）μg/片，RSD為8.99%（表2）。

圖3 專屬性考察Fig.3 Specificity test of RAPA

表1 回收率及精密度測(cè)定Table 1 Test of recovery and relative standard deviation（RSD）

表2 緩釋膜中RAPA含量測(cè)定Table 2 Determination of drug content of the sustained release film

2.1.5 RAPA穩(wěn)定性測(cè)定 通過RAPA穩(wěn)定性測(cè)定表明，以0.3% SDS溶液為釋放介質(zhì)的RAPA在0～15 d的峰面積為101.5～112.3，平均約107.4，提示以0.3%SDS溶液為釋放介質(zhì)的RAPA在15 d內(nèi)穩(wěn)定性好（表3）。

表3 RAPA穩(wěn)定性測(cè)定Table 3 Stability test of RAPA

2.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放分析結(jié)果

2.2.1 RAPA在不同溶劑中的溶解度考察 RAPA在20%乙醇、30%乙醇、0.1% Tween-80、0.5%Tween-80和0.3% SDS中的溶解度分別為：（15.0±6.1）、（100.0±8.4）、（6.5±4.6）、（14.8±6.2）、（548.0±25.4）μg/mL（圖4）。統(tǒng)計(jì)學(xué)兩兩比較分析提示，RAPA在20%乙醇、0.1% Tween-80、0.5% Tween-80中的溶解度均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），在30%乙醇、0.3%SDS中的溶解度與上述3組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），在30%乙醇與0.3%SDS中的溶解度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

RAPA在20%乙 醇、0.1% Tween-80、0.5%Tween-80中溶解度均較低，在30%乙醇中溶解度一般，均難達(dá)到漏槽條件，而在0.3% SDS溶液中的溶解度最大（圖4），滿足漏槽條件。

2.2.2 RAPA眼用緩釋膜體外釋放結(jié)果分析 通過RAPA眼用緩釋膜體外釋放研究發(fā)現(xiàn)，藥物釋放量隨時(shí)間推移逐漸增加。第1、2、3、5、8、11和第15天的峰值濃度分別為（50.97±12.28）%、（58.30±16.45）%、（57.39±12.35）%、（93.66±5.36）%、（95.46±2.98）%、（90.74±3.08）%、（90.18±3.98）%。統(tǒng)計(jì)學(xué)兩兩比較分析提示，第1、2、3天之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第5、8、11、15天的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第3天與第5天的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。RAPA體外釋放在第5天時(shí)基本達(dá)到峰值濃度，并持續(xù)維持至15 d。

圖4 RAPA在不同溶劑中的溶解度Fig.4 Solubility of RAPA in different solvents

圖5 RAPA眼用緩釋膜體外釋放曲線Fig.5 Release profile of RAPA sustained-release film

3 討論

通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以PLGA為載體的RAPA眼用緩釋膜，其15 d內(nèi)RAPA含量及穩(wěn)定性良好，同時(shí)體外釋放研究發(fā)現(xiàn)，藥物釋放量隨時(shí)間推移逐漸增加，在第5天左右達(dá)到峰值濃度，并持續(xù)維持至15 d左右，達(dá)到預(yù)期要求。

目前臨床上RAPA用于自身免疫性疾病和器官移植后抗排斥反應(yīng)的治療以全身給藥為主，但因全身給藥而帶來(lái)的口腔潰瘍（10%～19%）、間質(zhì)性肺疾?。?%～17%）、高脂血癥（30%～64%）、貧血（12%～76%）、白細(xì)胞減少（11%）、蛋白尿（10%）、淋巴水腫（6.4%～12%）等副作用不可避免［20］。常規(guī)抗青光眼手術(shù)中抗代謝藥的使用均以局部應(yīng)用為主，例如MMC、5-FU在術(shù)中的應(yīng)用［7-8］，且常為術(shù)中單次應(yīng)用，術(shù)后除了少數(shù)眼部并發(fā)癥外，未見全身嚴(yán)重并發(fā)癥報(bào)導(dǎo)［10，13-14］。因此本課題設(shè)計(jì)仍是以局部給藥，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每片緩釋膜的RAPA平均含量很低為（112.6±10.1）μg，給藥劑量遠(yuǎn)比全身給藥的量?。?1］，同時(shí)制成緩釋制劑，通過在青光眼濾過術(shù)區(qū)局部釋放15 d，達(dá)到局部抗瘢痕化的作用［19］。

既往很多研究表明PLGA具有良好的生物相容性，作為RAPA的常用載體已被多數(shù)人所采用［22-23］，因此本研究同樣選擇PLGA作為RAPA的載體材料。由于不同粘度PLGA降解時(shí)間不同，對(duì)藥物釋放的速度和程度有不同影響。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DL-PLGA50/50的特性粘度為0.55～0.75 dL/g時(shí)，其降解時(shí)間為1～2月，而當(dāng)DL-PLGA50/50的特性粘度為0.15～0.25 dL/g時(shí)，其降解時(shí)間為2～4周，但粘度偏小不易成膜，結(jié)合PLGA（特性粘度0.55～0.75 dL/g）使用容易成膜，且膜光滑無(wú)氣泡。文獻(xiàn)報(bào)道［24］，RAPA在37 ℃，pH為7.4的磷酸緩沖介質(zhì)中半衰期僅為13 h，又由于RAPA為難溶性藥物，在水中溶解度僅為2.6 μg/mL，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RAPA在20%、30%乙醇，和0.1%、0.5%Tween-80中溶解度均較低，難達(dá)到漏槽條件，而在0.3% SDS溶液中的溶解度最大，滿足漏槽條件，故實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)RAPA穩(wěn)定，且能達(dá)到漏槽條件的0.3% SDS溶液作為RAPA眼膜體外釋放介質(zhì)。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明［19］，RAPA眼用緩釋膜在兔子抗青光眼手術(shù)后濾過泡的抗瘢痕化的作用明顯，術(shù)后濾過泡形態(tài)可維持至28 d后，術(shù)后房水中RAPA的有效藥物濃度維持時(shí)間達(dá)2周以上，且無(wú)出現(xiàn)術(shù)后并發(fā)癥，而空白組和術(shù)中單用RAPA棉片浸泡組其濾過泡均在1周內(nèi)消失，因此，該RAPA眼用緩釋膜可明顯提高抗青光眼手術(shù)成功率。

綜上所述，一定行為學(xué)參數(shù)的RAPA眼用緩釋膜具有良好的緩釋性能，具有青光眼術(shù)后抗瘢痕化的應(yīng)用潛力。