唐小飾，溫燦鑫，潘 萍，李 予

（1.北京市航天總醫(yī)院婦產科，北京 100076；2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院婦產科生殖中心，廣東 廣州 510120）

促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）方案是體外受精或卵胞漿內單精子注射-胚胎移植（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF/ICSI-ET）治療中常用且結局良好的促排卵方案之一，但有部分卵巢儲備正常患者在該方案中發(fā)生卵泡發(fā)育的慢反應，導致周期取消率增加和妊娠率下降等不良結局。研究顯示在GnRH激動劑方案促排卵發(fā)生卵巢慢反應時，添加含黃體生成素（luteinizing hormone，LH）活性的藥物對臨床結局的改善作用優(yōu)于增加卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）劑量［1-2］。添加含LH活性的不同藥物，包括人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）、人重組黃體生成素（recombinant luteinizing hormone，rLH）及人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotro?pin，HMG），目前對這幾種不同藥物改善卵巢慢反應的效果無大樣本的臨床研究。因此，本研究擬探討卵巢儲備功能正?；颊卟捎肎nRH激動劑方案促排卵時發(fā)生卵巢慢反應，補充含LH活性的不同藥物對IVF結局的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2014年1月1日至2016年6月30日在本中心行IVF/ICSI-ET助孕的不孕患者，共納入872例進行回顧性分析。納入標準：①年齡＜40歲；②雙側卵巢同時存在，竇卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC）＞7個；③第1或2 IVF周期；④GnRH激動劑方案（包括長效長方案、短效長方案、超長方案），促性腺激素（gonadotropin，Gn）啟動量≥150 U/d；⑤慢反應的判斷標準［3］：Gn刺激卵巢5～8 d時，無卵泡＞10 mm且雌二醇（estradiol，E2）＜660 pmol/L；⑥促排卵中后期添加hCG、rLH或HMG。排除標準：既往無卵巢低反應史。本研究獲得中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院生殖倫理委員會批準，并取得患者知情同意。

1.2 促排卵方案與分組

1.2.1 長方案 于黃體中期單次肌肉注射0.93 mg或1.25 mg長效GnRH激動劑（曲普瑞林，法國益普生或德國輝凌），或于黃體中期每天皮下注射0.1 mg短效GnRH激動劑（曲普瑞林，法國益普生或德國輝凌公司），14 d后檢測外周血FSH、LH、E2、孕激素（progesterone，P），并通過經(jīng)陰道B超計數(shù)雙側卵巢卵泡數(shù)、卵泡徑線、卵巢容積及內膜情況。符合降調標準者（FSH＜5 U/L，LH＜5 U/L，E2＜185 pmol/L）予外源性Gn≥150 U/d啟動促排卵。Gn包括重組卵泡刺激素α（recombinantfolli?cle-stimulating hormone，rFSH-α）（果納芬，德國默克雪蘭諾公司）、尿促卵泡素（麗申寶，中國麗珠醫(yī)藥有限公司）或rFSH-β（普麗康，德國默沙東公司）。

1.2.2 超長方案 于月經(jīng)第2天開始注射GnRH激動劑（1.87～3.75 mg），末次GnRH激動劑注射3～4周后予外源性Gn≥150 U/d啟動促排卵。

1.2.3 分組促排卵第5～8天無卵泡直徑＞10 mm且E2＜660 pmol/L，補充含LH活性的藥物，分別為小劑量hCG（中國麗珠醫(yī)藥有限公司）100 U/d、rLH（樂芮，德國默克雪蘭諾公司）75～150 U/d或HMG（賀美奇，德國輝凌公司）75～150 U/d。根據(jù)補充LH活性的藥物不同分為hCG組（n=28）、rLH組（n=319）及HMG組（n=525）。其中hCG組包含曾用過HMG或rLH效果不明顯者15例，占hCG組53.6%。以HMG組為對照組，比較hCG組及rLH組與HMG組之間的實驗室參數(shù)及臨床結局。

1.3 扳機、取卵、體外受精與胚胎移植和黃體支持

當有2個卵泡直徑超過18 mm或3個直徑超過17 mm時注射hCG（人絨毛膜促性腺激素，中國麗珠醫(yī)藥有限公司）6 000～10 000 U或重組人絨促性素（艾澤，德國默克雪蘭諾公司）250 μg誘導卵子成熟。扳機后的36 h左右在經(jīng)陰道超聲的引導下行穿刺取卵術，穿刺所有直徑超過10 mm的卵泡。根據(jù)處理后的精液情況，決定行IVF/ICSI受精，胚胎按照常規(guī)培養(yǎng)3 d。依據(jù)Istanbul共識胚胎評分標準行胚胎評分［4］。于取卵后72 h，擇優(yōu)進行胚胎移植。根據(jù)不孕患者的年齡、是否為疤痕子宮及取卵數(shù)目等情況決定具體胚胎移植數(shù)目，余可利用胚胎玻璃化冷凍技術予以冷凍保存。取卵日開始給予每日肌肉注射黃體酮60 mg或陰道用微粒化黃體酮膠囊（安琪坦，比利時博賞公司）600 mg或黃體酮陰道緩釋凝膠（雪諾酮，德國默克雪蘭諾公司）90 mg。移植2周后測血β-hCG，若血β-hCG＞25 U/mL，為妊娠試驗陽性。移植后4～5周行經(jīng)陰道B超檢查，若宮內可見孕囊者診斷為臨床妊娠，并隨訪妊娠結局。

1.4 觀察指標

主要觀察指標為活產率；次要觀察指標為Gn使用量和使用天數(shù)及促排卵中性激素變化情況、獲卵數(shù)、2PN數(shù)、2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、冷凍胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、種植率、臨床妊娠率、流產率、多胎妊娠率。其中活產率為活產周期數(shù)/移植周期數(shù)。2PN受精率為2PN受精數(shù)/獲卵數(shù)；卵裂率為卵裂胚胎總數(shù)/（2PN+0PN+多PN受精數(shù)）；可利用胚胎率為可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎總數(shù)；種植率為宮腔內孕囊總數(shù)/移植胚胎總數(shù)；臨床妊娠率為臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)；流產率為流產周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)；多胎妊娠率為多胎妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，連續(xù)變量資料中正態(tài)分布變量以均數(shù)±標準差（）表示，非正態(tài)分布變量以四分位數(shù)［M（P25～P75）］表示，定性資料用率（%）表示；3組間均數(shù)比較，若滿足獨立、正態(tài)、方差齊性，采用單因素方差分析，若3組間差異有統(tǒng)計學意義，則采用LSD法進行兩兩比較；若不滿足則采用非參數(shù)檢驗Kruskal-WallisH檢驗，若3三組間差異有統(tǒng)計學意義，則采用Nemenyi法進行兩兩比較。3組間率的比較采用Chi-square檢驗，若3組間差異有統(tǒng)計學意義，則采用卡方分割進行兩兩比較。兩兩比較結果以HMG組為對照顯示。雙側檢驗，P＜0.05時認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者的基本資料

3組患者之間的年齡、不孕年限、不孕因素、體質量指數(shù)（body mass index，BMI）、基礎FSH及竇卵泡數(shù)等差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。3組之間基礎LH的差異有統(tǒng)計意義（Hc=8.520，P=0.014），經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hCG組的基礎LH高于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義［（5.14.2～7.6）vs.4.3（3.2～5.8）U/L，P=0.043；表1］。

2.2 促排卵情況

3組之間促排卵方案的差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13.485，P=0.001），經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hCG組采用超長方案促排卵比例高于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義（14.3%vs.1.1%，P＜0.001）。3組之間Gn使用天數(shù)及使用總量的差異均有統(tǒng)計學意義（Hc=19.382，P＜0.001；Hc=18.015，P＜0.001），經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hCG組Gn使用天數(shù)及使用總量多于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義［15.0（13.0～16.8）vs.13.0（12.0～15.0）d，P=0.027；2 925（2 531～3900）vs.2550（2100～3225）U，P=0.046］；rLH組Gn使用天數(shù)及使用總量低于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義［13.0（12.0～14.0）vs.13.0（12.0～15.0）天，P=0.009；2 400（1 950～3 075）vs.2 550（2 100～3 225）U，P=0.009］。3組之間在促排卵第5～7天FSH水平、E2水平及扳機日FSH水平、LH水平的差異均有統(tǒng)計學意義（Hc=18.044，P＜0.001；Hc=26.584，P＜0.001；Hc=42.405，P＜0.001；Hc=43.098，P＜0.001），經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hCG組在促排卵第5～7天的E2水平明顯低于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義［50.0（24.0～76.0）vs.87.0（53.0～149.0）ng/L，P＜0.001］；rLH組在促排卵第5～7天及扳機日FSH水平低于HMG組，扳機日LH水平高于HMG組，差異均有統(tǒng)計學意義［14.4（11.3～18.4）vs.16.3（12.6～20.6）U/L，P＜0.001；16.5（12.2～20.7）vs.19.3（15.2～24.7）U/L，P＜0.001；1.6（1.2～2.2）vs.1.3（0.9～1.8）U/L，P=0.001］。余無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表2）。

表1 三組患者的基本資料比較Table 1 Baseline data of patients in three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表1 三組患者的基本資料比較Table 1 Baseline data of patients in three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

BMI：body mass index；FSH：follicle-stimulating hormone；E2：estradiol；LH：luteinizing hormone；AFC：antral follicle count；1）hCG HCG group compared groupcompared to HMG group，P＜0.05；2）statistically significant.

2.3 實驗室相關參數(shù)比較

3組之間的獲卵數(shù)、2PN數(shù)的差異均有統(tǒng)計學意義（Hc=8.422，P=0.015；F=3.697，P=0.025），經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)，hCG組的獲卵數(shù)、2PN數(shù)低于HMG組，差異有統(tǒng)計學意義［8.0（6.3～11.0）vs.11.0（7.5～16.0），P=0.015；（5.4±3.2）vs.（7.7±4.4），P=0.007］。3組之間的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、冷凍胚胎數(shù)及移植胚胎數(shù)等差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表3）。

2.4 臨床結局相關參數(shù)比較

3組之間的種植率、臨床妊娠率、多胎妊娠率、活產率、流產率、異位妊娠率相當，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05；表4）

3 討論

GnRH激動劑方案仍然是目前臨床廣泛應用于IVF助孕的促排卵方案，垂體降調節(jié)后行卵巢刺激可表現(xiàn)為正常反應、低反應和慢反應，慢反應的判斷標準于2011年在業(yè)界達成共識，即卵巢儲備功能正常以及正常促性腺激素水平的不孕癥患者，使用GnRH激動劑長方案，在促排卵過程中發(fā)生以下情況：FSH刺激卵巢6～8 d，無＞10 mm卵泡，E2＜180 pg/mL；卵泡生長減慢，從每天增長1～2 mm減至3 d內增大小于2 mm。卵巢慢反應可能導致周期取消率增加、獲卵數(shù)減少、胚胎種植率和臨床妊娠率降低等不良結局［1-2］。卵巢慢反應的發(fā)生機制尚不明確，目前主要考慮以下兩個方面的影響因素。一方面，降調節(jié)使得垂體抑制過深從而導致內源性LH相對或絕對不足，這考慮為卵巢慢反應的主要原因［5-6］。GnRH激動劑的劑型、劑量及給藥途徑等對降調節(jié)的深度存在一定影響，有可能導致卵巢慢反應［5］。另一方面，有研究表明LH編碼區(qū)的多態(tài)性與LH活性的降低有關，降調節(jié)后LH進一步被抑制，從而不足以維持多卵泡發(fā)育，導致慢反應的發(fā)生。如常見的突變種類LH-β（variant 8Arg-15Thr）已報道與慢反應相關［7-8］。研究顯示，單次全量GnRH-a（3.75 mg）對垂體產生過深的抑制作用致LH分泌相對不足，與半劑量GnRH-a（1.87 mg）相比，其獲卵總數(shù)、受精卵子總數(shù)以及優(yōu)質胚胎數(shù)等都明顯減少，雖然種植率、妊娠率和流產率與半劑量組可達到相當水平，但是累計妊娠率明顯低于半劑量組［6］。我們在2012年的研究顯示三分之一劑量GnRH-a（1.25 mg）降調節(jié)與半劑量相比均無早發(fā)LH峰出現(xiàn)，但降調節(jié)后LH＜1.0 U/L的比例明顯降低、優(yōu)質胚胎率顯著增加，活產率呈增高的趨勢（42%vs.32%）［9］，并且長效GnRH-a的使用劑量與促排卵過程的LH呈負相關［10］。即GnRH-a適宜的使用劑量，避免垂體過度抑制有利于改善臨床結局。

表2 三組的促排卵情況Table 2 Stimulation characteristic in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表2 三組的促排卵情況Table 2 Stimulation characteristic in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

COH：controlled ovarian hyperstimulation；GnRH-a：gonadotropin releasing hormone agonist；Gn：gonadotropin；FSH：follicle-stimulating hormone；E2：estradiol；LH：luteinizing hormone；P：progesterone；1）statistically significant；2）hCG group compared to HMG group，P＜0.05；3）rLH group compared to HMG group，P＜0.05.

表3 三組間的實驗室相關參數(shù)比較Table 3 Laboratory variables in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

表3 三組間的實驗室相關參數(shù)比較Table 3 Laboratory variables in the three groups ［，M（P25～P75），%（n）］

1）statistically significant；2）compared to HMG group，P＜0.05

表4 三組間的臨床結局相關參數(shù)比較Table 4 Clinical variables in the three groups［n（%）］

GnRH激動劑方案中發(fā)生卵巢慢反應時常用的對策是適當增加FSH劑量或者添加含LH活性的制劑，研究顯示均可改善卵巢反應，增加獲卵數(shù)［11］。但是，國內外均有研究顯示發(fā)生卵巢慢反應時補充rLH的種植率和妊娠率高于增加FSH劑量［12-13］。但添加含LH活性的不同藥物對臨床結局的改善作用的療效比較缺乏大樣本的研究。因此，本研究針對卵巢慢反應添加含LH活性的不同藥物包括HMG、rLH及hCG，比較三者臨床結局的差異。

以添加HMG作為對照，rLH組Gn的使用天數(shù)及總量較HMG組偏少。Ferraretti等［14］的研究結果顯示卵巢反應不良者添加rLH或HMG組所使用Gn天數(shù)以及總量無明顯差異，而rLH組的種植率及妊娠率明顯高于HMG組。Dahan等［15］的研究顯示在竇卵泡數(shù)大于6個的卵巢慢反應患者，促排卵過程中添加rLH的妊娠結局高于添加HMG。而在本研究中卵巢儲備正常患者發(fā)生卵巢慢反應時，添加rLH組與添加HMG組的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、種植率、妊娠率、活產率無明顯差異。有研究顯示FSH聯(lián)合rLH與聯(lián)合HMG相比，促排卵過程中血清及卵泡液的激素水平相似，表明兩者促進卵泡發(fā)育與激素代謝的活性相當［16］。hCG組促排卵5 d后的雌二醇水平明顯低于rLH組和HMG組，顯示了該組盡管基礎LH正常且較其他組高，但由于超長方案的比例高，垂體抑制更為顯著，導致慢反應卵泡發(fā)育緩慢和雌激素的表現(xiàn)更為明顯；hCG組Gn的使用天數(shù)及總量較HMG組更多，考慮可能與慢反應程度更深，需要更長的促排時間有關；hCG組的獲卵數(shù)、2PN數(shù)較HMG組少，但是hCG組的2PN受精率、卵裂率、可利用胚胎率、種植率、妊娠率、活產率均能達到與HMG組相似的水平。hCG在結構上與LH相似，生物學活性也與LH接近，并且半衰期更長，與受體結合的親和力較高，生物學活性更強［17］，故適當添加hCG可以補充LH活性［18］。Filicori等［19］的研究表明，在不孕患者GnRH激動劑方案促排卵的后期添加小劑量hCG可以減少促排卵時FSH或HMG的使用量，并且不會導致過早黃素化，同時能達到促進卵泡發(fā)育的效果，獲得與單純添加rLH或HMG組相似的獲卵數(shù)、種植率及臨床妊娠率。本研究針對發(fā)生卵巢慢反應的患者，結果也顯示添加小劑量hCG與添加HMG的臨床結局相似。添加hCG組獲卵數(shù)、2PN數(shù)明顯少于添加HMG組，考慮hCG在促排卵中、后期階段有減少排卵前的小卵泡數(shù)的作用［19］；并且本研究中hCG組采用超長方案的比例明顯高于HMG組，不排除因降調節(jié)抑制過深導致獲卵數(shù)、2PN數(shù)偏少的可能。此外值得注意的是，添加hCG組中53.6%為前期添加HMG或rLH后卵巢慢反應表現(xiàn)未得到改善而改用hCG，最終臨床結局仍可得到改善。這表明hCG在添加HMG或rLH后效果不明顯者仍可獲得相當?shù)男Ч?。促排卵中、后期添加hCG可刺激卵泡生長和成熟，促進成熟卵泡發(fā)育［20］。

綜上所述，本研究表明卵巢儲備功能正常的患者在GnRH激動劑方案中發(fā)生卵巢慢反應時，添加含LH活性的不同制劑均可改善卵巢反應，獲得相似的臨床結局。在HMG或rLH添加后效果改善不明顯者，小劑量hCG的添加仍可獲得相當?shù)男Ч?/p>