田小超，何偉亮，賈 妍，武宇洲，金 鑫，劉素云*

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050051)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是一類(lèi)嚴(yán)重危害人類(lèi)身體健康的疾病，其主要發(fā)病機(jī)制是心肌缺血。血管再生可以改善心肌梗死患者的心肌缺血，故如何促進(jìn)缺血心肌血管再生已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。血管再生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，β-FGF)等促血管生長(zhǎng)因子參與其中，發(fā)揮著重要的作用。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)主要活性成分為正丁基苯酞，對(duì)急性腦梗死具有顯著治療作用[1-2]。心肌梗死和腦梗死的發(fā)病機(jī)制類(lèi)似，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),NBP通過(guò)促進(jìn)VEGF改善腦心缺血[3]，但NBP對(duì)心肌梗死血管再生的作用及機(jī)制仍需深入研究。最新研究表明Notch通路與心肌梗死等疾病關(guān)系密切[4]，激活Notch l通路能減輕創(chuàng)傷后心肌缺血再灌注損傷[5-6]。因此，本研究旨在探討NBP促進(jìn)心肌梗死大鼠血管再生的作用，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1藥品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器 NBP由石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20100041。體重為200～280 g的 SD大鼠由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證書(shū)：SCXK-冀-2008-1-003)，對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2大鼠心肌梗死模型的制備及分組 將大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，按線栓法制備大鼠心肌梗死模型：接多導(dǎo)電生理記錄儀觀察大鼠心電圖，氣管插管，接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸。于胸骨左緣第3、4肋間開(kāi)胸，暴露心臟，用5-0絲線結(jié)扎于冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending，LAD)，造成心肌梗死。結(jié)扎后心電圖Ⅰ和aVL導(dǎo)聯(lián)ST 段抬高且心肌組織變?yōu)樯n白色為造模成功。假手術(shù)過(guò)程與上述基本相同，但線栓并未置入 LAD。將大鼠分為假手術(shù)(Sham)組、心肌梗死(MI)組、NBP 低劑量(NBP-L，20 mg/kg組)和NBP高劑量(NBP-H，40 mg/kg)組，每組6只大鼠。模型成功后分別經(jīng)尾靜脈注射給予藥物治療，每天給藥1次，連續(xù)給藥2周。Sham組和MI組給予相同劑量的生理鹽水治療。

1.3心肌梗死面積的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死大鼠，迅速取出大鼠心臟組織，沿房室環(huán)方向?qū)⒆笮氖矣尚募庵列牡浊谐? mm厚的組織塊，置于20 g/L的氯化三苯基四氮唑溶液中，37 ℃孵育10 min，加入4%多聚甲醛固定24 h，用數(shù)碼相機(jī)拍照，用Image J軟件進(jìn)行圖像分析計(jì)算梗死面積。心肌梗死面積=每片切片壞死心肌之和/整個(gè)左心室面積×100%。

1.4心臟功能的檢測(cè) 10%水合氯醛麻醉大鼠后，將其置于自制木板上，超聲診斷儀檢測(cè)大鼠心臟超聲功能，并讀取左心室收縮末期壓(left ventricular end-systolic pressure，LVESP)、左心室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)、心室收縮時(shí)室內(nèi)壓最大上升速率(+dP/dt max)及左心室舒張時(shí)室內(nèi)壓最大下降速率(-dP/dt max)。

1.5心肌梗死邊緣區(qū)新生血管的檢測(cè) 取正常心肌與梗死心肌交界區(qū)的心肌即缺血心肌，制作石蠟組織塊，切片(5 μm厚)，行特異性免疫組織化學(xué)染色，SP法染色，二氨基聯(lián)苯胺顯色，一抗為兔抗鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體(購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)，顯微鏡下計(jì)數(shù)缺血區(qū)微血管密度，每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)觀察5處，取其平均值作為毛細(xì)血管密度。

1.6VEGF和β-FGF及Notch 1的基因表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取大鼠缺血心肌組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μg進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。采用SYBR Green染料法于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)，建立反應(yīng)體系的終體積為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。由 PCR 反應(yīng)曲線得到每個(gè)樣品的Ct值，以GAPDH作為內(nèi)參，用2-△△ct法進(jìn)行計(jì)算目的基因的表達(dá)量。引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成，引物序列為：VEGF，F(xiàn):5′-GCACTGGACCCTGGCTTTAC-3′,R:5′-CCCGCACACCGCATTAGG-3′;FGF，F(xiàn):5′-TTCACAGCCTGTGCTCTAGGG-3′,R:5′-GAT-CGGGTCAGGTTTTGGAAA-3′;Notch 1，F(xiàn):5′-GAGGCTTGAGATGCTCCCAG-3′,R:5′-ACGG-CAGGCACAGCGATAG-3′;GAPDH，F(xiàn):5′-ACC-ACAGTCCATGCCATCAC-3′,R:5′-TCCACCAC-CCTGTTGCTGTA-3′。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較分別采用F檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NBP對(duì)各組大鼠心肌梗死面積的作用 Sham組大鼠均未見(jiàn)心肌梗死灶，MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率大于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于MI組,NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于NBP-L組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別心肌梗死面積Sham組0.00±0.00MI組48.41±4.96?NBP-L組37.19±4.81?#NBP-H組28.95±3.75?#△F值22.276P值0.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05 與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗(yàn))

2.2NBP對(duì)各組大鼠心臟功能的影響 MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max低于Sham組，LVED高于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max高于MI組，LVED低于MI組，NBP-H組大鼠LVESP、+dp/dt max、-dp/dt max高于NBP-L組，LVED低于NBP-L組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3NBP對(duì)各組大鼠梗死邊緣區(qū)新生毛細(xì)血管的作用 NBP-L組和NBP-H組心肌梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度高于MI組，NBP-H組心肌梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度高于NBP-L組(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.4NBP對(duì)各組大鼠血管再生相關(guān)因子(VEGF和β-FGF)的作用 MI組大鼠心肌VEGF、FGF mRNA水平低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于Sham組和MI組,NBP-H組VEGF和-FGF mRNA水平高于NBP-L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.5NBP對(duì)各組大鼠Notch信號(hào)通路中Notch 1基因的影響 MI組大鼠心肌組織中Notch 1基因表達(dá)明顯低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達(dá)高于Sham組和MI組，NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達(dá)高于NBP-L組(P<0.05)，見(jiàn)表5。

組別LVESP(mmHg)LVEDP(mmHg)+dp/dt max(mmHg/s)-dp/dt max(mmHg/s)Sham組169.68±16.899.07±0.976 213.17±588.993 527.89±415.14MI組113.54±13.95?16.03±0.81?3 496.52±321.39?2 230.77±220.05?NBP-L組130.19±10.91?#14.18±1.07?#4 260.41±580.27?#2 502.67±215.84?#NBP-H組148.42±12.14?#△11.86±1.00?#△5 116.97±531.40?#△3 077.91±287.43?#△F值18.72457.61830.55923.194P值0.0000.0000.0000.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗(yàn))；1 mmHg=0.133 kPa

組別新生毛細(xì)血管密度值MI組17.01±1.57NBP-L組21.30±2.15?NBP-H組32.98±3.25?#F值107.389 P值0.000

*P值<0.05與MI組比較 #P值<0.05與NBP-L組比較(SNK-q檢驗(yàn))

組別VEGF mRNAβ-FGF mRNASham組1.01±0.191.01±0.17MI組0.64±0.08?0.71±0.11?NBP-L組1.40±0.22?#1.27±0.20?#NBP-H組2.12±0.39?#△2.01±0.29?#△F值40.72543.956P值0.0000.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05 與NBP-L組比較(SNK-q檢驗(yàn))

組別Notch 1 mRNASham組1.01±0.19MI組0.70±0.11?NBP-L組1.38±0.17?#NBP-H組1.91±0.24?#△F值48.772P值0.000

*P值<0.05與Sham組比較 #P值<0.05與MI組比較 △P值<0.05與NBP-L組比較(SNK-q檢驗(yàn))

3 討 論

缺血性心臟病已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的主要疾病之一，如何改善心肌缺血區(qū)血流量成為治療心肌梗死的關(guān)鍵和研究的熱點(diǎn)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，血管再生可以增加缺血心肌的血流灌注，挽救頓抑心肌，改善心臟功能[7-8]。因此，探索新的以血管再生為治療靶點(diǎn)的心肌梗死藥物具有極其重要的價(jià)值。NBP是一種新型的抗腦缺血的藥物，國(guó)內(nèi)指南中已批準(zhǔn)用于治療腦梗死[9]。研究發(fā)現(xiàn)，NBP可改善大鼠腦缺血再灌注后微血管形態(tài)和密度，促進(jìn)血管再生對(duì)腦血管缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[10-12]。另外， NBP能改善大鼠心肌梗死模型心臟血流動(dòng)力學(xué)功能和減少心臟梗死面積，對(duì)大鼠心肌具有保護(hù)作用[13]。然而，關(guān)于NBP是否通過(guò)調(diào)控血管再生對(duì)心肌梗死起保護(hù)作用的研究較少。

本研究結(jié)果顯示，MI組、NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率大于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于MI組,NBP-H組大鼠心肌梗死面積百分率小于NBP-L組(P<0.05)。NBP能夠降低大鼠心肌梗死面積，改善大鼠心肌梗死后心臟功能，表明NBP對(duì)心肌梗死大鼠具有保護(hù)作用。微血管密度是反映血管再生的可靠的指標(biāo)。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)梗死灶邊緣區(qū)的微血管密度，結(jié)果表明NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌組織中微血管密度要高于MI組。VEGF和β-FGF是目前動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)研究得較為深入的促進(jìn)血管再生的活性因子[14-15]。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了心肌組織中VEGF mRNA和β-FGF mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MI組大鼠心肌VEGF、FGF mRNA水平低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于Sham組和MI組,NBP-H組VEGF和β-FGF mRNA水平高于NBP-L組(P<0.05)。表明NBP能夠促進(jìn)血管再生相關(guān)因子VEGF和β-FGF的表達(dá)。所以，NBP可以促進(jìn)心肌梗死大鼠VEGF和β-FGF因子在缺血心肌中的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)缺血心肌血管再生，增加缺血心肌的血液供應(yīng)，對(duì)心肌梗死的大鼠心肌組織產(chǎn)生保護(hù)功能。

Notch信號(hào)通路主要對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中的一類(lèi)受體Notch 1在心肌的發(fā)育、存活和分化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[16]。Notch 1通路通過(guò)促進(jìn)心肌再生、誘導(dǎo)血管新生等來(lái)保護(hù)心肌[17]。敲除Notch 1可引起冠狀動(dòng)脈畸形和心肌異常[18]。然而，尚未見(jiàn)到有關(guān)Notch 1通路是否在NBP介導(dǎo)的心肌梗死大鼠血管再生中發(fā)揮作用的報(bào)道。因此，本研究通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了缺血心肌組織的Notch 1基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MI組大鼠心肌組織中Notch 1基因表達(dá)明顯低于Sham組，NBP-L組和NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達(dá)高于Sham組和MI組，NBP-H組大鼠心肌中Notch 1基因表達(dá)高于NBP-L組(P<0.05)。表明NBP能夠激發(fā)Notch 1通路，促進(jìn)血管再生，對(duì)心肌梗死后大鼠的心肌產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，NBP可通過(guò)激活Notch 1通路促進(jìn)心肌梗死后大鼠血管再生能力，對(duì)心肌梗死大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用，為心肌梗死的治療提供了新的理論基礎(chǔ)，有利于研發(fā)心肌梗死的新干預(yù)靶點(diǎn)和治療藥物。