何 建 陳 芳 李海龍 趙延梅 楊漢青 余長升 馬 英* 郭新建

(1.青海省地方病預(yù)防控制所，西寧，811602；2.青海省第五人民醫(yī)院，西寧，810007；3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院，西寧，810001)

高原低氧適應(yīng)是指世居高原的人或動物為能在高原低氧環(huán)境中生存，經(jīng)長期自然選擇所產(chǎn)生的一種非可逆但能穩(wěn)定遺傳的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理生化等方面的改變，是機(jī)體適應(yīng)高原低氧環(huán)境的一種保護(hù)機(jī)制[1]。高原哺乳動物圍繞氧氣的獲取、運輸和利用通路在血液生理和生化方面的特征性變化，是低氧研究的重要基礎(chǔ)性內(nèi)容，其適應(yīng)機(jī)制主要是圍繞缺氧而建立起的一系列復(fù)雜的代償，也是近幾年研究的熱點問題。

血液是機(jī)體重要的內(nèi)環(huán)境，直接參與機(jī)體物質(zhì)代謝、能量代謝和復(fù)雜的生化過程。動物血液生理、生化指標(biāo)不僅能反映生理狀況和健康狀況，也是反映機(jī)體代謝狀況最靈敏的指標(biāo)之一。它是動物長期進(jìn)化的結(jié)果，是對棲息環(huán)境長期適應(yīng)的反映，因而具有物種特性，在研究動物適應(yīng)性方面具有重要的參考價值[2]。高原動物低氧適應(yīng)的生理與遺傳機(jī)制一直是亟待解決的科學(xué)難題，而青藏高原哺乳動物具有良好的適應(yīng)高原低氧環(huán)境的特性，國內(nèi)關(guān)于青藏高原動物血液生理指標(biāo)的研究報道很多，多見于家牦牛(Bosgrunniensgrunniens)[3]、藏野驢(Equuskiang)[4]、野馬(Equuscaballus)[5]、藏綿羊(Ovisariessubsp.)[6]、藏豬(Susscrofasubsp.)[7]，小型嚙齒類的研究有高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)和高原鼢鼠(Myospalaxbaileyi)等[8]。

喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)屬嚙齒目(Rodentia)、松鼠科(Sciuridae)、旱獺屬動物，廣泛棲息于高寒草甸草原，主要分布在我國青海、西藏、云南德欽等地及與中國接壤的尼泊爾等國的青藏高原邊緣山地。喜馬拉雅旱獺作為青藏高原鼠疫的主要貯存宿主[9]，長期生活在低氧濃度環(huán)境中，對低溫、低氧及強(qiáng)紫外線等高原環(huán)境具有良好適應(yīng)，是研究高原低氧適應(yīng)機(jī)理的理想實驗動物。為更好研究喜馬拉雅旱獺對高原低氧環(huán)境的生理適應(yīng)性，本文測定了連續(xù)梯度海拔分布的喜馬拉雅旱獺血液生理相關(guān)指標(biāo)，對相應(yīng)海拔段的喜馬拉雅旱獺心肺標(biāo)本做了病理組織切片并進(jìn)行了鏡檢。旨在分析旱獺在高海拔低氧環(huán)境下的血液生理變化，發(fā)現(xiàn)高原動物低氧適應(yīng)的血液生理和心肺機(jī)能適應(yīng)特征，為高原低氧對動物組織造成的損傷提供參考資料，對進(jìn)一步揭示青藏高原野生動物低氧適應(yīng)分子遺傳機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 樣點選擇

結(jié)合青海動物地理區(qū)劃，選擇本省境內(nèi)西部荒漠亞區(qū)的烏蘭縣(3 200—3 400 m)、青海藏南亞區(qū)的囊謙縣(3 600—3 800 m)、興?？h(3 800—4 000 m)、澤庫縣(4 000—4 200 m)作為現(xiàn)場采樣點，采用圈套法捕獲喜馬拉雅旱獺。樣點分布見圖1。

圖1 全球喜馬拉雅旱獺的分布區(qū)域(藍(lán)線標(biāo)記區(qū)域，https：//www.iucnredlist.org/)和本研究喜馬拉雅旱獺采樣點分布圖(采樣點用紅色圓點標(biāo)記)Fig.1 Global distribution area of Marmota himalayana(distribution area was marked with blue line，https：//www.iucnredlist.org/) and sample sites for Marmota himalayana in this study(sample sites were marked with red dot)

2 材料與方法

2.1 血液采樣

靜脈注射5%戊巴比妥鈉麻醉喜馬拉雅旱獺后，心臟采血3—5 mL，置于抗凝管并存放于冰盒。共采集旱獺血樣192份，其中烏蘭46份、囊謙46份、興海47份、澤庫53份。

2.2 血液生理指標(biāo)測定

輕輕混勻血樣，采用PE6800 Vet全自動血液分析儀測定紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(HBC)、血細(xì)胞比容(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)等生理指標(biāo)。生理指標(biāo)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行多個樣本均數(shù)的兩兩比較分析，定量檢測結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2.3 喜馬拉雅旱獺組織病理學(xué)觀察

將現(xiàn)場麻醉后的喜馬拉雅旱獺解剖，取心、肺組織鹽水沖洗后固定于4%甲醛溶液，常規(guī)組織脫水、浸蠟、石蠟包埋組織、組織切片(厚4 μm)，HE染色，光鏡觀察。

3 研究結(jié)果

3.1 喜馬拉雅旱獺血液生理指標(biāo)

本次實驗的各項血液生理指標(biāo)統(tǒng)計值見表1，烏蘭縣喜馬拉雅旱獺血樣測定的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)、血紅蛋白含量(HGB)、血細(xì)胞比容(HCT)值最高，而囊謙縣旱獺的RBC、HGB、HCT數(shù)值最低。平均紅細(xì)胞體積(MCV)隨海拔的升高而降低，MCV減小，使RBC總表面積增大，氧和二氧化碳等脂溶性氣體通過RBC進(jìn)行交換數(shù)量增多，這是旱獺為適應(yīng)低氧而發(fā)生的血液生理改變。

表1 不同海拔喜馬拉雅旱獺各項血液生理指標(biāo)平均值

Tab.1 Average blood physiological indexes of different altitude himalayan marmot

表2 不同海拔喜馬拉雅旱獺各項血液生理指標(biāo)的單因素方差分析

Tab.2 One-way ANOVA analysis of variance of blood physiological indexes in marmot of different altitude

注：基于實測平均值，*平均值差值的顯著性水平為0.05

Note：Based on the measured average value，* The significance level of the mean difference was 0.05

表2通過生理指標(biāo)組間數(shù)據(jù)單因素方差分析，紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白在烏蘭、興海、澤庫3縣的喜馬拉雅旱獺之間無顯著差異，囊謙縣的這3項數(shù)值有顯著差異；血細(xì)胞比容在興?？h和澤庫縣之間沒有差異外，其他相互各縣之間均有差異；平均紅細(xì)胞體積在囊謙縣和興?？h之間沒有差異外，其他相互各縣之間均有差異；血小板數(shù)值在各縣之間均無顯著差異。

賈榮莉[10]測定喜馬拉雅旱獺的紅細(xì)胞數(shù)量為(5.82±0.78)×1012/L，血紅蛋白(145±17.0)g/L。陶元清[11]測得白化喜馬拉雅旱獺血液生理指標(biāo)，其紅細(xì)胞數(shù)(5.98±0.74)，血紅蛋白含量為(154.21±13.75)，血小板數(shù)(365.58±173.29)，本實驗測得的紅細(xì)胞數(shù)、血紅蛋白含量及血小板數(shù)與文獻(xiàn)大致接近。

3.2 心肺組織學(xué)觀察結(jié)果

顯微鏡下觀察喜馬拉雅旱獺心肺組織的HE染色切片，4個地區(qū)的心肺切片中均有不同程度的損傷，詳見圖2、圖3。

圖2 不同海拔喜馬拉雅旱獺心肺組織切片(HE染色)Fig.2 Cardiopulmonary tissue sections of Himalayan marmot at different altitude(HE staining)

圖3 心肺組織切片局部放大圖(HE染色)Fig.3 A partial enlarged view of the cardiopulmonary tissue section(HE staining)

烏蘭縣：部分區(qū)域心肌細(xì)胞腫脹變性，肌橫紋模糊。肺間質(zhì)有散在的炎癥細(xì)胞浸潤，終末細(xì)支氣管散在的淋巴細(xì)胞浸潤，血管充血，肺泡結(jié)構(gòu)清晰。

囊謙縣：心肌細(xì)胞變性，肌橫紋模糊，細(xì)胞腫脹。肺間質(zhì)內(nèi)出血，部分區(qū)域有肺泡間隔增寬，肺泡腔內(nèi)可見組織細(xì)胞，終末細(xì)支氣管可見淋巴細(xì)胞浸潤。

興海縣：心肌細(xì)胞肌橫紋模糊，肌細(xì)胞萎縮，心肌間有散在的出血，心肌細(xì)胞濁腫變性。肺間質(zhì)充血、出血，炎細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)增寬，肺泡上皮增生，部分脫落，肺泡腔內(nèi)有液性滲出，組織細(xì)胞反應(yīng)。終未細(xì)支氣管襯覆的纖毛柱狀上皮細(xì)胞脫落、變性壞死。

澤庫縣：心肌細(xì)胞間動脈血管充血，血管內(nèi)皮損傷，靜脈淤血，心肌細(xì)胞變性，心肌橫紋模糊，細(xì)胞腫脹。肺泡間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增寬，纖維組織增生，間質(zhì)內(nèi)出血，肺泡上皮細(xì)胞增生、脫落，較多肺泡腔內(nèi)有組織細(xì)胞反應(yīng)，液性滲出，終末細(xì)支氣管襯覆的纖毛柱狀上皮細(xì)胞變性，部分區(qū)域脫落。

從喜馬拉雅旱獺心肺組織染色鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其心肌和肺泡細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能相應(yīng)發(fā)生了一些變化，說明長期生長在海拔3 000 m以上的旱獺，已經(jīng)適應(yīng)了氧分壓低、紫外線強(qiáng)、寒冷晝夜溫差變化大等特點的高寒低氧棲息環(huán)境。

4 討論

血液生理特征是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的一個重要表現(xiàn)，血液生理指標(biāo)能直接反應(yīng)機(jī)體對低氧環(huán)境的適應(yīng)性[12]。馮永志等報道[13]海拔3 700 m處空氣氧含量僅為海平面的59.3%，為適應(yīng)這種嚴(yán)重缺氧，依靠一般的血紅蛋白攜氧能力和心輸出量的改變，已不能適應(yīng)生理需要。馮信焰等[14]研究發(fā)現(xiàn)海拔越高，空氣中含氧量越低，HGB水平就越高，海拔高度與HGB水平呈正相關(guān)，高原低氧環(huán)境是影響HGB水平變化的主要因素。紅細(xì)胞數(shù)目(RBC)及血紅蛋白(HGB)的作用是增強(qiáng)高原動物機(jī)體運載氧能力，其含量增多是許多高原動物的血液學(xué)特征，且數(shù)值隨海拔升高而相應(yīng)升高，原因可能是在缺氧環(huán)境下紅細(xì)胞代償性增加，通過增殖以及合成血紅蛋白來提高攜氧能力，以適應(yīng)高海拔缺氧環(huán)境[15-16]。本研究中囊謙、興海和澤庫3縣的采集樣點生境均為草甸草原，并且喜馬拉雅旱獺RBC、HGB、HCT數(shù)值也隨著海拔的升高而呈上升趨勢，說明同一生境中，隨海拔的升高RBC、HGB、HCT值也會相應(yīng)逐漸增加。烏蘭縣的生境類型為荒漠化草原，雖然海拔最低，但RBC、HGB、HCT值卻很高，提示我們棲息生境可能也是旱獺血液生理指標(biāo)值的一個影響因素。

高原動物在長期適應(yīng)低氧環(huán)境的過程中，紅細(xì)胞和血紅蛋白的變化有相同點，但由于不同高原動物的生活環(huán)境和生活習(xí)性不同，其紅細(xì)胞和血紅蛋白存在不同的適應(yīng)特征。王曉君等[8]研究發(fā)現(xiàn)鼠兔以低血細(xì)胞比容(HCT)和低平均紅細(xì)胞體積(MCV)為特征，血氧利用率高。同時高原鼢鼠也表現(xiàn)出與鼠兔類似的血液性狀。藏羚(Pantholopshodgsoni)也有著與高原鼠兔相似的血液學(xué)特征，表現(xiàn)為低HBC和低HCT[17]。而野牦牛(Bosgrunniensmutus)、家牦牛、藏綿羊和藏山羊(Caprahircussubsp. )的血液具有較高的紅細(xì)胞數(shù)(RBC)和血紅蛋白濃度(HBC)。通過研究可以看出[18]，RBC的總表面積增大，氧氣和二氧化碳等通過RBC進(jìn)行交換的數(shù)量增多，直接提高了單位體積血液的攜氧能力。但HCT升高會增加血液黏稠度和血液循環(huán)阻力，增加了循環(huán)系統(tǒng)負(fù)擔(dān)，以至于影響氧氣供應(yīng)，甚至損害機(jī)體[19]。為了避免這種損傷，機(jī)體MCV隨海拔的升高而降低，適當(dāng)降低了血漿的黏滯度，促進(jìn)血流速度加快，從而提高機(jī)體氧代謝效率[20]。我們研究發(fā)現(xiàn)旱獺與藏綿羊、藏豬及牦牛等高原動物類似，適應(yīng)高原低氧環(huán)境的生理特征主要表現(xiàn)為RBC和HGB增加，相對擴(kuò)大的表面積使得更多的氧氣易于與紅細(xì)胞接觸，提高了氧氣運輸效率，而MCV的減小意味著平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量變化幅度變小，將紅細(xì)胞內(nèi)黏度維持在一個可接受的水平，從而一定程度上降低了高流速下的血液黏度，防止HCT的過度升高。同時MCV減小會增大紅細(xì)胞的總表面積，提高了內(nèi)環(huán)境的氧氣交換效率，保證機(jī)體在低氧環(huán)境中機(jī)體氧氣供應(yīng)的需要，從而提高機(jī)體氧代謝機(jī)能，這種血液特征進(jìn)一步揭示了喜馬拉雅旱獺適應(yīng)高原低氧環(huán)境的生理機(jī)制。

氧的利用和調(diào)節(jié)是高等生命生存的基本條件，低氧是許多重大疾病發(fā)生發(fā)展中的基本病理生理改變，而高原低氧存在于中國約220萬km2的高原地區(qū)，涉及高原低氧習(xí)服和低氧適應(yīng)的重要進(jìn)化機(jī)制[21]。國外資料表明，高原低氧對心臟重構(gòu)的作用主要是指右心室重構(gòu)包括心肌實質(zhì)的改變、心室壁增厚或心腔擴(kuò)大、質(zhì)量和體積增加[22]。本研究喜馬拉雅旱獺的心肺組織HE切片顯示，4個地區(qū)的心肺組織均有不同程度的病變，高原缺氧導(dǎo)致在本區(qū)域內(nèi)生活的喜馬拉雅旱獺心肺一定的損傷。說明喜馬拉雅旱獺長期生活在高原低氧環(huán)境中，經(jīng)受地下洞穴中低水平的氧氣和高水平二氧化碳的環(huán)境，雖經(jīng)過漫長的進(jìn)化后存在一定的低氧適應(yīng)，但這種適應(yīng)并不足以替代缺氧對機(jī)體引起的損傷。