李鳳菊 郭學(xué)軍 (濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，濮陽(yáng) 457001)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus， SLE)是一種累及多臟器、多系統(tǒng)損害的，嚴(yán)重影響人類正常生活的，呈多種免疫異常的復(fù)雜自身免疫性疾病，臨床主要特征為全身多器官組織如腎臟、皮膚、血管及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等部位的免疫復(fù)合物沉積和炎癥/壞死反應(yīng)[1-4]。其發(fā)病機(jī)制是遺傳因素與環(huán)境因素等共同作用導(dǎo)致的患者免疫平衡紊亂。多項(xiàng)研究表明，異常B細(xì)胞失調(diào)產(chǎn)生大量自身抗體，T細(xì)胞的表達(dá)和功能異常以及異常T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病。

Th17細(xì)胞是一種以白細(xì)胞介素IL-17的分泌為特征的效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群，它具有與傳統(tǒng)的T細(xì)胞亞群Th1和Th2細(xì)胞不同的功能特征[5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞可能參與了系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的免疫功能異常，但在SLE中作用的具體機(jī)制仍不完全明了。研究表明，SLE患者外周血中Th17細(xì)胞增加，且Th17細(xì)胞可能參與SLE患者的腎炎、血管炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染以及自身抗體的產(chǎn)生[6]。目前，Th17細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的研究表明，其對(duì)SLE的靶向治療有很大的應(yīng)用前景[7]。

羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ)是一種常用的治療或預(yù)防瘧疾的藥物，同時(shí)，它也是一種抗風(fēng)濕性藥物，可以減輕風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、盤(pán)狀紅斑狼瘡或SLE癥狀[8,9]。因此，羥氯喹在臨床得到了廣泛的應(yīng)用，已成為治療SLE的必備藥物。研究表明，羥氯喹可以抑制IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等促炎細(xì)胞因子的生產(chǎn)[10]。然而，目前羥氯喹對(duì)SLE患者以及體外分化的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的影響機(jī)制尚不明確。本文旨在研究羥氯喹對(duì)SLE患者Th17細(xì)胞分化的影響。

1 資料與方法

1.1資料 選取2017年9月至2018年9月30例SLE患者均符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中男性5人，女性25人，年齡16～50歲(平均年齡35.4歲)，病程1～70個(gè)月(平均病程18.1個(gè)月)。征得他們的同意后，我們采取兩組治療方案。一組治療方案用藥為強(qiáng)的松，另一組治療方案用藥為強(qiáng)的松+羥氯喹。在治療前后，分別采用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-17的濃度，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)SLE患者的Th17水平。同時(shí)在治療后對(duì)他們進(jìn)行動(dòng)態(tài)隨訪。

另外選擇了20例年齡、性別構(gòu)成與上述病例相匹配的健康志愿者作為健康對(duì)照組?；颊吆徒】抵驹刚呋拘畔⒁?jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1體外分離、培養(yǎng)T細(xì)胞以及刺激分化Th17細(xì)胞 體外實(shí)驗(yàn)，我們從健康志愿者血液體外培養(yǎng)分化出Th17細(xì)胞。從健康志愿者中靜脈采血2 ml，肝素抗凝，淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用10%的胎牛血清1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml-1，從外周血單核細(xì)胞中純化出T細(xì)胞，具體如下：PBS清洗后加入混合抗體(抗-CD14、CD56、CD19、CD8、CD235a)，4℃孵育10 min，加入包被有人抗鼠IgG Ab的Depletion Dynabeads，除去PBMC中非CD4+T細(xì)胞，在上清中加入抗CD25 Dynabeads 4℃孵育25 min，將CD4細(xì)胞分選成CD25+Tregs細(xì)胞和CD25-Treps細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定分離細(xì)胞純度。將細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1 ml，分別加入包含CD3/CD28抗體-磁珠(5 μl/ml)、IL-1β(50 ng/ml)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β(1 ng/ml)、IL-6 (30 ng/ml)、IL-23(5 ng/ml)、IL-4抗體(5 ng/ml)、IL-12抗體(5 ng/ml)、IL-2抗體(20 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，刺激分化出Th17細(xì)胞。其中，所有細(xì)胞因子和抗體均來(lái)自Peprotech。

表1 患者和志愿者基本信息表[n(%)]
Tab.1 Information of patients and volunteers[n(%)]

InformationPatientswithSLE(n=30)Control(n=20)Averageage(year)35.432.8Agerange16-20yearsold2(6.7%)1(5%)21-30yearsold7(23.3%)4(20%)31-40yearsold13(43.3%)10(50%)41-50yearsold6(20%)4(20%)51-60yearsold2(6.7%)1(5%)GenderMale5(16.7%)3(15%)Female25(83.3%)17(85%)Pathogenesis1-6months5(16.7%)None7-12months6(20%)None13-24months12(40%)None25-36months4(13.3%)None≥37months3(10%)None

培養(yǎng)液分為兩組，一組作為正常對(duì)照組，另一組加入20 μmol/L的HCQ[11]，用于分析羥氯喹對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響。

1.2.2流式細(xì)胞分析法檢測(cè)PBMC中Th17細(xì)胞的表達(dá) 我們分離出SLE患者的外周血單核細(xì)胞，在含50 ng/ml佛波酯(PMA)、750 ng/ml離子霉素的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后加入20 μg/ml莫能霉素混勻后繼續(xù)培養(yǎng)5 h。用PE-Cy5/CD3抗體和FITC/CD8抗體染色15 min，再用PE/IL-17抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色。最后，以CD3+CD8-設(shè)門(mén)，用流式細(xì)胞儀分析Th17細(xì)胞。

在體外實(shí)驗(yàn)中，我們從原始T細(xì)胞刺激分化出Th17后，用含/不含羥氯喹的培養(yǎng)液培養(yǎng)6 d，然后用FITC/CD4抗體和PE/IL-17抗體進(jìn)行染色，用流式細(xì)胞儀從CD4+T細(xì)胞中篩選出IL-17+細(xì)胞。此外，我們用熒光素CFSE標(biāo)記原始T細(xì)胞，然后在有/沒(méi)有羥氯喹的Th17細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 d，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)CFSE+細(xì)胞的比例。

1.2.3ELISA檢測(cè)IL-17的濃度 ELISA試劑盒購(gòu)自eBioscience公司。收集SLE患者及健康對(duì)照組的血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-17濃度。此外，分離出的T細(xì)胞在有/沒(méi)有羥氯喹的Th17細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)6 d后，用ELISA檢測(cè)上清中IL-17的濃度。

1.2.4PCR基因表達(dá)分析 使用Trizol試劑(購(gòu)自Invitrogen)從SLE患者和健康對(duì)照組的PBMC中純化總RNA，采用PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA，加入SYBR Premix EX Taq RT-PCR Master Mix (TaKaRa)后，用Bio-Rad iCycler 7500光學(xué)系統(tǒng)測(cè)定mRNA表達(dá)。以β-actin為內(nèi)參采用2-ΔΔCt法計(jì)算變異倍數(shù)。使用的引物對(duì)如下：Hum β-actin(F：ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A；R：CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA)；Hum IL-17A(F:AAA GTG GCC CGG ATG TGA GA；R：GAC ATT GTG CCC TGC CCT TCT)；ROR-γt(F:TGA GAA GGA CAG GGA GCC AA;R:CCA CAG ATT TTG CAA GGG ATC A)；FOXP3(F：GAA ACA GCA CAT TCC CAG AGT TC；R：ATG GCC CAG CGG ATG AG)，引物均購(gòu)自瑞博。

2 結(jié)果

2.1HCQ抑制SLE患者Th17細(xì)胞分化和IL-17產(chǎn)生 ELISA結(jié)果顯示，HCQ與強(qiáng)的松聯(lián)合治療與單純強(qiáng)的松治療相比，前者抑制了IL-17的產(chǎn)生(圖1A)。同樣，RT-PCR結(jié)果顯示，聯(lián)合治療后的SLE患者PBMC中IL-17 mRNA表達(dá)也比單純強(qiáng)的松治療的結(jié)果有所降低(圖1B)。此外，我們還對(duì)FOXP3的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)估，因?yàn)樗荰reg細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[12]。我們發(fā)現(xiàn)HCQ和強(qiáng)的松聯(lián)合治療與單純強(qiáng)的松治療相比，并不能有效提高FOXP3基因的表達(dá)(圖1C)。

26例SLE患者在HCQ治療后的動(dòng)態(tài)隨訪中，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，HCQ +強(qiáng)的松治療4周后，Th17細(xì)胞百分比受到了抑制(圖2A)，但是，HCQ+強(qiáng)的松治療后Treg細(xì)胞的百分比卻增加(圖2B)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，HCQ+強(qiáng)的松聯(lián)合治療4周后，SLE患者血清中IL-17的產(chǎn)生降低(圖2C)，F(xiàn)OXP3 mRNA基因表達(dá)增加(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明，HCQ聯(lián)合治療可以抑制SLE患者Th17細(xì)胞的擴(kuò)增和IL-17的產(chǎn)生。

2.2HCQ抑制體外Th17細(xì)胞分化和IL-17的產(chǎn)生 從健康志愿者的外周血單核細(xì)胞中分離純化出人T細(xì)胞，在有/沒(méi)有HCQ的Th17細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。流式細(xì)胞術(shù)分析表明，HCQ抑制了CD4+IL-17+Th17細(xì)胞的分化(圖3A)。此外，我們發(fā)現(xiàn)HCQ可以抑制IL-17的產(chǎn)生和基因表達(dá)(圖3B和3C)。同時(shí)，RORγt是Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果表明HCQ也抑制了RORγt的產(chǎn)生(圖3D)。此外，HCQ阻止CD4+IL-17+Th17細(xì)胞擴(kuò)張的能力隨時(shí)間變化(圖3E)。同時(shí)，HCQ還可以抑制CFSE標(biāo)記的Th17細(xì)胞的增殖(圖4A、B)。這些數(shù)據(jù)均表明，HCQ可以抑制體外Th17細(xì)胞的分化和IL-17的產(chǎn)生。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+IL-17+Th17細(xì)胞百分比(n=3)Fig.3 HCQ inhibits Th17 cell differentiation and IL-17 production in vitro(n=3)Note: A.The percentage of CD4+IL-17+Th17 cells was analyzed by flow cytometry (n=3)；B.The concentration of IL-17 in supernatants was analyzed by ELISA (n=3)；C.Expression of IL-17 mRNA was analyzed by RT-PCR (n=3)；D.Naive CD4+T cells were cultured for 12 days in conditions designed to induce Th17 differentiation,with or without 20 μmol/L HCQ;the gene expression of retinoic acid receptor related orphan receptor gamma t (RORγt) was analyzed by RT-PCR；E.The number of CD4+IL-17+cells could be induced in a time-dependent manner,and 20 μmol/L HCQ could time-dependently inhibit CD4+IL-17+cell proliferation (n=3).

圖4 CFSE+Th17細(xì)胞的含量Fig.4 Content of CFSE+Th17 cellsNote: A.Sorted naive CD4+T cells were labeled with CFSE and cultured for 6 days in conditions designed to induce Th17 cell differentiation,with or without 20 μmol/L HCQ.CFSE+Th17 cells were analyzed by flow cytometry；B.The percentage of CFSE+among CD4+cells.

3 討論

Th17細(xì)胞是Th細(xì)胞的促炎亞群，在自身免疫疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[13]。Th17細(xì)胞強(qiáng)有力的促炎活性可能導(dǎo)致SLE的許多病理特征，如誘導(dǎo)血管炎癥、白細(xì)胞募集、B細(xì)胞激活和自身抗體的產(chǎn)生[14]。多項(xiàng)研究表明，在SLE患者外周血中Th17細(xì)胞和IL-17都增加了，且在這些患者的皮膚病變、肺和腎臟中也發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞的增長(zhǎng)[15]。因此，我們推測(cè)抑制Th17細(xì)胞或?qū)笽L-17可能是治療SLE的有效治療方法。本實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，HCQ和強(qiáng)的松聯(lián)合治療與單獨(dú)使用強(qiáng)的松治療相比，前者抑制了SLE患者Th17細(xì)胞分化和IL-17的產(chǎn)生，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在HCQ處理數(shù)周后Th17細(xì)胞和IL-17的產(chǎn)生也受到了抑制。此外，我們的體外研究進(jìn)一步證實(shí)HCQ抑制了Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞數(shù)量增殖和IL-17的產(chǎn)生。綜上，HCQ可抑制Th17細(xì)胞，減輕后續(xù)炎癥反應(yīng)是SLE治療的強(qiáng)效藥。

Treg細(xì)胞可以調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞的功能，從而維持免疫穩(wěn)態(tài)[16]。眾所周知，在SLE患者發(fā)病時(shí)，循環(huán)Treg細(xì)胞的數(shù)量會(huì)減少，并且Treg細(xì)胞的免疫抑制功能受損[17]。我們的研究表明，經(jīng)過(guò)強(qiáng)的松和HCQ聯(lián)合治療后，體內(nèi)Treg細(xì)胞百分比和FOXP3基因表達(dá)均上升，這表明HCQ有可能促進(jìn)了Treg細(xì)胞的分化。但是，強(qiáng)的松和強(qiáng)的松加HCQ治療的平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FOXP3表達(dá)的顯著差異，我們推測(cè)Treg細(xì)胞和FOXP3基因在體內(nèi)表達(dá)上升可能是由于強(qiáng)的松的作用。