藍常貢 龍麗珍 謝克恭 劉 佳 周蘭島 潘生才 梁俊卿 涂振陽 高子然 唐毓金

(右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科，百色 533000)

研究表明，TLR4和CD14是內毒素或脂多糖(LPS)介導的信號傳導通路中的兩個受體。CD14與LPS-LBP結合形成LPS/LBP/CD14復合物，TLR4-MD2與復合物LPS/LBP/CD14 相互作用，激活胞內包括NF-κB等信號傳導通路，最終引起NF-κB活化和AP-1磷酸化，誘導炎性反應及其細胞因子表達。故認為LPS信號傳導通路與多種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展關系密切[1]。TLR4和CD14基因位于染色體的不同位置，TLR4位于染色體9q32-33上，CD14基因位于5q上，TLR4和CD14基因的變異對不同個體的內毒素和LPS的反應性可能有重要的影響[2，3]。但是否與結核病有關系尚未清楚。因此，本課題選擇百色地區(qū)原住壯族人群作為研究對象，所有原住壯族人群三代內均未與其他民族通婚，而且離開本地連續(xù)時間未超過6個月，選擇從2011年1月到2017年12月共180例患者，其中，脊柱結核患者60人、肺結核患者60人和健康對照者60人。采用DNA測序法對三組人群CD14基因序列及包含TLR4基因 12874位點 T/C的突變(Asp299Gly) 基因序列、13174位點 G/A突變 (Thr399Ile)的基因序列進行測序，研究百色地區(qū)原住壯族人群有無基因多態(tài)位點及其分布特征，并比較三組人群的基因分布特點。

1 資料與方法

1.1資料 選取2011年1月～2017年12月在右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院體檢健康人群60例、住院肺結核患者60例和脊柱結核患者 60例。健康人群60例(對照組)中，男29例，女31例，年齡22～50歲，平均(39.86 ±3.12)歲。脊柱結核組 60例中，男38例，女22例;年齡21～56歲，平均(42.42 ±2.02)歲。肺結核組 60例中，男28例，女32例;年齡18～52歲，平均(41.98 ±2.17)歲。三組性別和年齡比較差異均無顯著性(P>0.05)，具有可比性。所有三組壯族人群三代內均未與其他民族通婚，而且離開本地連續(xù)時間未超過6個月。

1.2實驗方法

1.2.1標本采集 住院當日或門診體驗當日采取靜脈血2 ml，放置1 h后以1 500 r/min離心1 min，取上清，放置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆茫萌詣由瘷z測儀-邁瑞B(yǎng)S-2000M免疫熒光法常規(guī)測定血清總IgE和sIgE；同時另外采取靜脈血2 ml，加入抗凝劑EDTA后置于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?，準備提取DNA(利用chelex-100快速提取法提取DNA模板)。

1.2.2CD14及TLR4引物設計 根據NCBIGenBank數據庫和Primer3程序對TLR4基因序列進行引物設計，引物包含TLR4基因序列AF177765，通過對包含TLR4基因12874位點T/C突變(Asp299Gly)、13174位點G/A突變(Thr399 Ile)的基因序列進行引物設計。引物1(包含A12874G)為5′-GGTTTAGAAGTCCATCGTTT-3′和5′-GGAAGTGAAAGTAAGCCTTT-3；引物2 (包含C13174T)為5 ′-CCACATTGAAACTCAAATCT-3和5-TGAGGTT-TCTGAGTGATAGG-3′。同理對CD14進行引物設計，通過對包含CD14基因序列AC116353和包含CD14基因轉錄起始點前720位至起始點后2650位的基因序列進行引物設計，見表1。

1.2.3PCR擴增、產物分析及純化測序反應 制備反應體系總體積為30 μl，其中，去離子水 18 μl，10×buffer 和Mg2+各3 μl，Taq 聚合酶 2 μl，上下游引物模板DNA 各1 μl，dNTP 1 μl。擴增熱循環(huán)過程條件：95℃ 預變性3 min，94℃變性1 min，55℃復性30 s，72℃延伸1 min，共計35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取3 μl PCR反應產物加至凝膠孔，5 V/cm 電泳;用手提式長波紫外燈隨時檢查電泳狀況，當DNA Ladder最前泳帶或指示劑離陽極端適當位置時結束電泳。 轉至紫外透射分析儀觀察結果。分別利用MultiScreen96試劑盒對PCR產物進行純化和MegaBACE1000全自動毛細管測序儀對PCR產物進行測序。

表1 CD14序列測定引物表
Tab.1 CD14 sequence determination of primer table

PrimerSequence(5′-3′)Length(bp)DirectionSize(bp)Tm(℃)CD14X2F1GTTGATTTGGTTCTGTTCC19F46852.43CD14X2R1TCACGAAATCGAAGAAAGGA19R53.12CD14X2F2ACTGTAGGGTCCTAATGTAT20F45553.68CD14X2R2GAAATCTTTGCCGAGATCCT20R53.41CD14X2R3GAGGATCTGGAGACGAGAGA18F47552.89CD14X2R3TTCGACCTTTCACGTTCA18R53.42CD14X2F4AGCTCCTGGATTTCTATTGG20F47953.49CD14X2R4CTGTCTAACTCCCTCAAGT20R53.31CD14X2F5GATCTGGAGTCGGTGTTGA19F41052.68CD14X2R5CGTCAAACTCAGGTAAGTA19R53.42CD14X2F6CTCCACCTATTGGACTGTGA20F1253.97CD14X2R6TCCCTCAATCCTACTTCTTT20R53.72

1.3統計學處理 利用統計分析軟件 SPSS18.0進行統計學分析，用頻率計數法計算脊柱結核組、肺結核組和健康組TLR4基因12874位點A/G突變(Asp299Gly)、13174位點C/T突變(Thr399Ile)多態(tài)性和CD14位點基因型以及等位基因頻率，然后經Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗。不同組別各等位基因及基因型頻率用χ2檢驗。P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結果

2.1TLR4基因分析 60例脊柱結核患者、肺結核患者和60例健康對照組均未發(fā)現TLR4基因12874位點A/G的突變 (ASp299Gly)和13174位點C/T突變(Thr399Ile)，見圖 1，提示百色地區(qū)原住壯族人群上述兩位點的突變并不常見。

2.2CD14基因分型 采用基因序列測定及分析，百色地區(qū)原住壯族人群存在CD14/-159多態(tài)性，未發(fā)現其他多態(tài)位點。 CD14/-159不同基因型測序圖見圖2。

2.3CD14基因頻率分析 脊柱結核組、肺結核組和健康對照組的基因型頻率和等位基因頻率見表2，按Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，脊柱結核組、肺結核組和健康對照組三組含有T等位基因攜帶者的基因型頻率和等位基因頻率分布,差異有顯著統計學意義(P<0.05)。

圖1 TLR4基因12874位點A/T 、13174位點C/T多態(tài)性凝膠電泳圖(8%聚丙稀酰胺)Fig.1 Gel electrophoresis of polymorphism of TLR4 gene loci 12874 A/T and loci 13174 C/T (8% polypropylene amide)Note: M.PCR marker;2,4,5,6.A/T genotype;1,3,7,8.C/T genotype.

圖2 CD14/-159基因型測序圖(2、3和4分別顯示AA、AT和TT基因型)Fig.2 CD14/-159 gene sequencing diagram (2,3 and 4 respectively show AA,AT and TT genotype)

表2 三組CD14/-159 基因型頻率和等位基因頻率比較
Tab.2 Comparison of CD14/-159 genotype frequency and allele frequency in each groups

GroupsCaseGenotypefrequency(%)TCTTCCAllelefrequency(%)TCControlgroup6025.063.311.770.929.1Pulmonarytuberculosisgroup6035.051.713.364.635.4Spinaltuberculosisgroup6040.043.311.766.332.2χ25.4328.4621.9187.3212.016P0.0250.0040.4620.0210.059

3 討論

3.1Toll樣受體4基因多態(tài)性 研究表明TLR4基因至少有兩種基因多態(tài)性[4]；而且TLR4基因多態(tài)性與多種感染性疾病發(fā)生發(fā)展關系密切[5]；Azzam等[6]研究發(fā)現TLR4基因多態(tài)性與潰瘍性結腸有關；Skevaki等[7]認為TLR4基因多態(tài)性與感染性疾病有關；Lorenz[8]和Winters等[9]研究提示TLR4基因多態(tài)性與新生兒早產有關。

本研究利用DNA測序法對百色地區(qū)180例原住壯族人群進行TLR4位點Asp299Gly和Thr399Ile的基因多態(tài)性檢測，未明確發(fā)現Asp299Gly和Thr399Ile位點基因突變，此研究結果與孫鈺鋒等[10]國內學者及Feng等[11]國外學者的研究結果基本相似。由此推測，相對于西方白種人而言，百色地區(qū)原住壯族人群的TLR4基因多態(tài)性“Asp299Gly”和“Thr399Ile”攜帶者的比例可能較低。

3.2CD14基因多態(tài)性 據研究表明，CD14基因有多個多肽位點的基因，CD14基因多態(tài)性主要表現在啟動子-159位堿基C和堿基T的轉換；另有報道CD14/-260位點也有多態(tài)性，但不同的研究工作者對起始密碼子位點計數的差異導致啟動子多態(tài)性位點尚未有定論。如藺靜等[12]對118例健康獻血員進行了 CD14/-159位點基因型檢測，等位基因T和C的頻率分別為60.2%和39.8%，有40例為T等位基因純合子(TT)， 62例為雜合子(TC)，C等位基因純合子有16例(CC)。湖北健康兒童CD14/-159位CC、CT、TT基因型頻率分別是13.9%、58.3%和27.8%[13]。還有胡海芳[14]、馮凱等[15]對新疆和重慶等地的漢族健康獻血員的CD14/-159基因多態(tài)性研究結果提示其他地區(qū)漢族CD14/-159基因多態(tài)性分布相當廣泛，而且T等位基因和TT基因型頻率遠高于國外人群，在日本、捷克等其他國家也有報道存在 CD14/-159 C/T多態(tài)性。本研究對180例百色地區(qū)原住壯族人群的CD14啟動子進行了基因測序，包含CD14轉錄起始點前720位至啟動子后2650位的基因序列，結果提示啟動子區(qū)-159位存在C/T的基因多態(tài)性，但沒有發(fā)現其他多態(tài)位點，而且百色地區(qū)原住壯族人群CD14/-159基因多態(tài)性以堿基TT為主，脊柱結核組和肺結核組的堿基T等位基因頻率分別占70.9%和64.6%，經檢驗符合Hardy-Weinberg平衡，可以代表百色地區(qū)原住壯族人群的樣本狀況。本研究結果與重慶地區(qū)漢族人群獻血員檢測結果基本一致；由此可見， CD14/-159 C/T多態(tài)性在不同種族人群普遍存在，但國外報道多以TC基因型為主，提示不同種族人群可能存在不同的基因型。上述研究均提示TC基因型是當地人群的主要基因型。是否不同地區(qū)人群確實存在基因學的差異，抑或是實驗方法的差異導致上述不同，可能還需進行進一步的研究證實。

3.3CD14/-159多態(tài)性和脊柱結核 肺結核易感基因主要分為人類白細胞抗原基因(human leukocyte antigen,HLA)和非白細胞抗原基因(非HLA)。后者主要有：維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)、Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、自然抗性相關性巨噬細胞蛋白1基因(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)等，目前Lee等[16]研究提示VDR的Fok Ⅰ 基因的攜帶者患結核病風險比不攜帶者高1.34倍；在TLRs基因研究23個基因位點后發(fā)現TLR1的rs5743618G/T基因位點和TLR8 rs3764879C/G、rs3764880A/G兩個基因位點與肺結核易感相關[17]；國內楊秉芬等[18]在研究活動性肺結核患者中，NK細胞表面高表達CD244與非結核患者無顯著差異，還有張憲波等[19]研究CD44在肺結核患者體內的表達水平明顯高于對照組且有顯著差異。本研究結果顯示壯族人群的TLR4的兩個基因位點Asp299Gly和Thr399Ile也與肺結核無明顯差異，與Dittrich等[20]研究有類似結論。

相對于脊柱結核，肺結核易感基因多態(tài)性研究比較多且結論不盡相同。在脊柱結核易感基因研究中，CD14是內毒素(LSP)介導的信號傳導通路中細胞反應的重要受體，CD14在脊柱結核也是重點研究的易感基因。在通常細菌感染的炎癥反應中，CD14受體剌激Th1細胞因子表達，基因多態(tài)CD14存在使Th2表型持續(xù)繼而發(fā)生脊柱結核傳染。既往研究表明CD14基因多態(tài)性與骨關節(jié)結核易感轉移有比較多的爭議[21,22]。本研究表明，相對于肺結核組和健康組，脊柱結核組CD14的基因型頻率及基因頻率差異無統計學意義(P>0.05)，提示百色地區(qū)原住壯族人群存在CD14基因多態(tài)性，但該多態(tài)位點與脊柱結核的易感性無明顯相關性。王冰潔等[23]對CD14/-159基因多態(tài)性進行研究并對其多態(tài)性及其啟動因子進行研究，提示CD14/-159及其啟動因子可能與基因環(huán)境相互作用，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展。肺結核與脊柱結核基因多態(tài)性的研究可能存在相近的易感基因或者完全不同的易感基因，因此有必要研究不同水平LPS暴露和其他多態(tài)位點對CD14的影響以及CD14基因多態(tài)性與脊柱結核發(fā)病的關系。