朱一喜 何樹光 陳超英 唐玲麗 (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院檢驗(yàn)科，長沙 412000)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是于孕早期出現(xiàn)2次及以上自然流產(chǎn)，且多發(fā)生于同一妊娠月份，嚴(yán)重影響患者身心健康，需采取針對性治療措施改善患者妊娠結(jié)局，提高分娩率[1]。研究表明，因胎兒基因受父系及母系兩者所決定，而妊娠作為半同種移植過程，一般需要通過有效免疫調(diào)控維持免疫平衡，避免因母體免疫系統(tǒng)排斥導(dǎo)致流產(chǎn)，因此免疫失衡在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)起重要作用，其中淋巴細(xì)胞免疫治療作為臨床常用治療方法，可改善患者免疫失衡，療效獲得認(rèn)可[2]。程序性死亡因子1(programmed death factor-1，PD-1)及程序性死亡因子配體1(programmed death factor-ligand 1，PD-L1)為當(dāng)前免疫治療關(guān)注熱點(diǎn)，并在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫中具有重要作用[3]。此外，有研究顯示PD-1/PD-L1在腎癌、肺癌、膀胱癌等惡性腫瘤存在異常表達(dá)，還可能參與母體免疫耐受誘導(dǎo)及維持妊娠過程[4]。但當(dāng)前國內(nèi)外關(guān)于PD-1/PD-L1與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)相關(guān)性鮮有報道，且多集中于動物模型及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，基于此，本研究對比健康人群與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者PD-1/PD-L1在外周血T淋巴細(xì)胞中表達(dá)水平，并探究其可能作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2015年7月～2017年2月本院收治的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者57例為觀察組，年齡23～38歲，平均(29.04±3.58)歲；流產(chǎn)次數(shù)2～6次，平均(3.18±0.52)次。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)病史詢問及系統(tǒng)檢查均符合美國生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會制定的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②夫婦雙方染色體正常；③處于非妊娠期，距上次流產(chǎn)3個月以上；④封閉抗體陰性；⑤丈夫精液分泌正常，且性功能無障礙；⑥本研究經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)；⑦患者知曉本研究并自愿參加。排除標(biāo)準(zhǔn)：①生殖道器質(zhì)性病變；②存在生殖道感染及內(nèi)分泌病史；③自身免疫性疾病、心肝腎等嚴(yán)重疾??；④凝血功能障礙；⑤近期接受影響PD-1/PD-L1水平藥物；⑥中途退出研究者。另選取42例正常妊娠婦女為對照組，年齡22～37歲，平均(29.52±3.17)歲，孕周<12周，經(jīng)B超檢查為宮內(nèi)妊娠且有胎心搏動，無既往流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史。兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)并具有可比性。

1.1.2儀器與試劑 選用美國貝克曼CytoFLEX 流式細(xì)胞儀及其相應(yīng)配套溶血劑，并采用法國IMMUNOTECHS.A.S公司生產(chǎn)的單克隆熒光抗體CD3-APC、CD4-PerCP、CD8-FITC、PD-1-PE及PD-L1-PE。

1.2方法

1.2.1樣本制備 抽取所有受試者(患者于治療前抽取)空腹外周靜脈血3 ml，EDTA-K2抗凝，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+50 μl全血，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+5 μl PD-1-PE+50 μl全血，1支流式管加入5 μl CD3-APC+5 μl CD4-PerCP+5 μl CD8-FITC+5 μl PD-L1-PE+50 μl全血。將試劑輕微混勻后于室溫避光孵育30 min，隨后加入相應(yīng)溶血劑于室溫避光孵育12 min，待完全溶血后，離心洗滌，再加入500 μl鞘液重懸細(xì)胞并上機(jī)檢測，結(jié)果以陽性率(%)表示。

1.2.2患者淋巴細(xì)胞免疫治療方案 所有患者丈夫經(jīng)血脂、肝功能、生化等項(xiàng)目檢查，確保指標(biāo)正常并可提供血源治療，若任意一項(xiàng)檢查未符合標(biāo)準(zhǔn)可篩選健康無關(guān)個體提供淋巴細(xì)胞來源。確定來源后，空腹抽取患者丈夫及健康無關(guān)個體靜脈血30 ml，與等量生理鹽水混勻并離心收集淋巴細(xì)胞，并調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至2×1010～3×1010L-1。在左手前臂內(nèi)側(cè)分3點(diǎn)皮內(nèi)注射，患者每2周接受1次治療，共進(jìn)行4次治療。最后于治療結(jié)束后2周接受PD-1/PD-L1檢測并安排受孕，經(jīng)檢測確認(rèn)妊娠后繼續(xù)接受淋巴細(xì)胞免疫治療，治療至妊娠20周。

1.2.3妊娠成功標(biāo)準(zhǔn) 對患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，妊娠超過28周，經(jīng)超聲檢查未見異常并分娩活嬰。

2 結(jié)果

2.1對比兩組外周血T淋巴細(xì)胞比例 觀察組CD3+、CD8+顯著低于對照組，CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對照組(P<0.05)，詳見表1。

2.2對比兩組PD-1/PD-L1在T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 觀察組PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+顯著低于對照組(P<0.05)，詳見表2。

GroupsPD-1/CD4+PD-1/CD8+PD-L1/CD4+PD-L1/CD8+Observationgroup(n=57)15.02±2.418.94±1.9523.14±3.499.16±1.78Controlgroup(n=42)17.36±2.6912.37±2.6426.28±4.5113.84±1.95t4.5447.4393.90612.415P0.0000.0000.0000.000

GroupsPD-1/CD4+PD-1/CD8+PD-L1/CD4+PD-L1/CD8+Beforetreatment15.02±2.418.94±1.9523.14±3.499.16±1.78Fourweeksaftertreatment16.14±2.171)10.37±2.461)24.72±3.671)10.04±1.851)Eightweeksaftertreatment17.52±2.361)12.58±2.781)26.59±4.361)11.96±2.031)

Note：Compared with before treatment，1)P<0.05.

Note：Compared with before treatment，1)P<0.05.

2.3患者治療前后PD-1/PD-L1在T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 患者治療后4周、治療后8周PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均顯著高于治療前(P<0.05)，詳見表3。

2.4對比患者不同妊娠結(jié)局PD-1/PD-L1在T淋巴細(xì)胞表達(dá)水平 57例患者接受淋巴細(xì)胞免疫治療后，妊娠成功43例，妊娠失敗14例。妊娠成功組PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均顯著高于治療前，且顯著高于妊娠失敗組(P<0.05)，詳見表4。

3 討論

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)作為臨床較難治療的不孕癥，發(fā)病率約為5%，流產(chǎn)前兆多表現(xiàn)為腰酸、乳房脹痛、小腹隱痛等臨床癥狀，對患者身體健康造成嚴(yán)重威脅，也影響家庭關(guān)系。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，其原因較為復(fù)雜，國內(nèi)外研究顯示，免疫、感染、遺傳、環(huán)境等因素均可導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生[6,7]。有臨床研究表明，為維持母體正常妊娠需依賴于封閉抗體，封閉抗體主要經(jīng)胚胎人類Ⅱ類抗原以及滋養(yǎng)淋巴細(xì)胞交叉抗原產(chǎn)生，并與母體淋巴抗原或胎盤中滋養(yǎng)細(xì)胞抗原相結(jié)合，從而防止其被母體免疫系統(tǒng)識別殺傷，避免有害免疫應(yīng)答發(fā)生，最終達(dá)到維持正常妊娠目的[8-10]。因此，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生多因母體封閉抗體不足導(dǎo)致胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞受免疫攻擊而流產(chǎn)。國內(nèi)學(xué)者研究顯示，血清中可溶性程序性死亡分子1及其配體可溶性程序性死亡分子L1異常增高，不利于妊娠，從而引起流產(chǎn)[11]。對此，本研究檢測PD-1/PD-L1在患者T淋巴細(xì)胞上表達(dá)水平，探究其可能作用機(jī)制。

T淋巴細(xì)胞作為重要免疫細(xì)胞之一，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞為其主要亞群，可反映封閉抗體效率，并影響孕期母胎耐受形成，而效應(yīng)T細(xì)胞活化異常以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T，Treg)抑制作用降低將導(dǎo)致復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[12-14]。因此，臨床需采用有效治療手段改善母體免疫失衡狀態(tài)。近期臨床研究顯示，PD-1與其配體PD-L1在母胎免疫耐受方面具有重要作用[15]。PD-1作為負(fù)性協(xié)同刺激分子，可在樹狀突細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞等造血細(xì)胞中誘導(dǎo)性表達(dá)[16]。PD-1的配體有PD-L1、PD-L2兩種，其中PD-L1的分布范圍較PD-L2更廣，也是臨床研究主要配體，其不僅同PD-1在巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等造血細(xì)胞中大量表達(dá)，經(jīng)活化后水平呈上升趨勢，并且在星形膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及上皮細(xì)胞等非造血細(xì)胞中大量表達(dá)[17]。PD-1與PD-L1主要在T細(xì)胞免疫應(yīng)答及免疫穩(wěn)態(tài)中扮演重要角色，兩者相結(jié)合后在機(jī)體免疫應(yīng)答中通過免疫受體酪氨酸抑制基序傳入抑制信號起負(fù)性調(diào)控作用，抑制細(xì)胞增殖與活化，并抑制細(xì)胞存活，同時對Treg細(xì)胞產(chǎn)生及分化起促進(jìn)作用，并增強(qiáng)Treg細(xì)胞功能[18,19]。

本研究結(jié)果顯示，觀察組CD3+、CD8+顯著低于對照組，CD4+、CD4+/CD8+顯著高于對照組，可見復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者處于免疫失衡狀態(tài)，其中CD8+T細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子、溶血細(xì)胞活性與子宮胎盤發(fā)育存在密切聯(lián)系，從而可能影響胎兒的生長發(fā)育，引發(fā)流產(chǎn)。段忠亮等[20]在研究中檢測顯示，患者外周血T細(xì)胞中PD-1比例明顯降低，其可作為治療潛在靶點(diǎn)。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測PD-1及其配體PD-L1在T淋巴細(xì)胞當(dāng)中表達(dá)水平，結(jié)果顯示，觀察組PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+顯著低于對照組，可見PD-1/PD-L1在T淋巴細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，推測PD-1/PD-L1信號通路在建立及維持母體免疫耐受過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，與段忠亮研究結(jié)果相一致?？赡転檫m應(yīng)胚胎植入，母胎界面微環(huán)境及免疫系統(tǒng)發(fā)生適應(yīng)性改變以維持母胎免疫耐受，并且免疫細(xì)胞間、非免疫細(xì)胞與免疫細(xì)胞間相互作用影響胎盤形成、母胎免疫耐受，因PD-1多在T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表達(dá)，PD-L1則主要在專職抗原提呈細(xì)胞中廣泛表達(dá)，從而在誘導(dǎo)母體免疫耐受中發(fā)揮重要作用[21]。但針對其具體作用機(jī)制仍需深入研究，進(jìn)而有效預(yù)防病理性妊娠疾病發(fā)生，改善妊娠結(jié)局?；颊咧委熀?周、治療后8周PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均顯著高于治療前。本研究結(jié)果同伍金華[22]研究顯示患者經(jīng)淋巴細(xì)胞免疫治療后CD3+PD-1+T細(xì)胞水平明顯提高相似，也充分證明淋巴細(xì)胞免疫治療方式有效性，改善機(jī)體免疫功能，提高妊娠率。推測因患者接受淋巴免疫治療后，PD-1及配體PD-L1水平上升促使封閉抗體產(chǎn)生，從而保護(hù)胎兒，維持母體免疫耐受。對所有患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，結(jié)果顯示，妊娠成功43例，妊娠失敗14例，妊娠成功組PD-1/CD4+、PD-1/CD8+、PD-L1/CD4+、PD-L1/CD8+均顯著高于治療前，且顯著高于妊娠失敗組，表明通過治療PD-1與PD-L1數(shù)量有所提高，其可作為觀察淋巴細(xì)胞免疫治療效果的有效檢測指標(biāo)，也為臨床治療復(fù)發(fā)性流產(chǎn)開辟新思路。

綜上所述，PD-1/PD-L1在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血T淋巴細(xì)胞中表達(dá)水平明顯降低，在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)展過程中具有重要意義，患者接受淋巴細(xì)胞免疫治療后PD-1/PD-L1表達(dá)水平顯著上升，但妊娠失敗者PD-1/PD-L1水平仍處于較低水平，PD-1及其配體PD-L1可作為臨床治療該疾病的潛在靶點(diǎn)。但因本研究整體納入對象較少，未明確PD-1/PD-L1信號通路在母胎界面作用效應(yīng)，本結(jié)論可能存在偏倚，應(yīng)在大量臨床樣本研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究PD-1/PD-L1在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的具體作用機(jī)制，為臨床治療提供準(zhǔn)確理論依據(jù)，從而利于母嬰健康及人類繁殖。