吳文宇 楊 柱 龍奉璽 羅 莉 魏顯鰻 稅會(huì)利 唐東昕

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科,貴陽(yáng) 550001)

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌的發(fā)病率和死亡率均比較高，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重危害，有效防治肝癌的發(fā)生發(fā)展是臨床工作中面臨的艱巨而緊迫的問(wèn)題。肝癌起病隱匿，預(yù)后差，肝癌的發(fā)生經(jīng)歷了慢性肝炎、肝硬化、肝癌前病變、肝癌等漫長(zhǎng)的病情發(fā)展過(guò)程，肝硬化是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肝癌前病變的形態(tài)學(xué)特征為異型增生結(jié)節(jié)，異型增生結(jié)節(jié)為肝硬化結(jié)節(jié)發(fā)展的結(jié)果，是肝癌啟動(dòng)、促進(jìn)、演變過(guò)程的中間環(huán)節(jié)，阻斷肝硬化結(jié)節(jié)向肝異型增生結(jié)節(jié)發(fā)展是阻斷肝癌的理想時(shí)機(jī)[1]。葛花解酲方由豆蔻仁、葛花、砂仁、炒神曲、白術(shù)、干姜、澤瀉、茯苓、豬苓、橘皮、人參、木香、青皮組成，具有分消酒濕、溫中健脾、消補(bǔ)兼施的功效，在治療酒精性肝病中具有良好效果，研究發(fā)現(xiàn)葛花解酲方對(duì)肝癌的發(fā)生發(fā)展也有阻止作用[2，3]，但其機(jī)制尚不完全清楚。GST-Pi在癌前階段已開(kāi)始表達(dá)，是肝癌的早期診斷指標(biāo)[4，5]；PCNA為細(xì)胞核增殖相關(guān)抗原，可作為增殖期的標(biāo)志物[6]；Wnt/β-catenin信號(hào)通路在惡性腫瘤的生長(zhǎng)、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮中藥作用，參與惡性腫瘤的增殖過(guò)程[7，8]。本文通過(guò)對(duì)葛花解酲方對(duì)乙醇性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌前病變GST-Pi和PCNA表達(dá)及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響進(jìn)行研究，探討葛花解酲方逆轉(zhuǎn)肝癌前病變的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性、6～8周齡、體重20～24 g、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠100只，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，許可證號(hào)：SCXK(軍)2012-0018。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用藥 豆蔻仁15 g，葛花15 g，砂仁15 g，炒神曲6 g，白術(shù)6 g，干姜6 g，澤瀉6 g，茯苓4.5 g，豬苓4.5 g，橘皮4.5 g，人參4.5 g，木香1.5 g，青皮0.9 g，所有藥材購(gòu)自北京同仁堂大藥房，按照藥方配方制成濃度為4 g/ml水煎劑備用。

1.1.3主要試劑 紅星二鍋頭白酒(北京紅星股份有限公司)，免疫組化染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、HE染色試劑盒(美國(guó)Sigma公司)，兔抗鼠GST-Pi單克隆抗體、兔抗鼠PCNA單克隆抗體、兔抗鼠Wnt-1多克隆抗體、兔抗鼠β-catenin多克隆抗體等抗體(英國(guó)Abcam公司)等。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 將100只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、模型組、葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組，每組25只。

1.2.2建立肝癌癌前病變小鼠模型 將模型組、葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組小鼠給予53%(v/v)紅星二鍋頭灌胃，10 ml/(kg·d)，每天灌胃1次，對(duì)照組小鼠每天等量生理鹽水灌胃，共20周。

1.2.3各組小鼠處理 葛花解酲方組和葛花解酲方+LiCl組小鼠在每天紅星二鍋頭灌胃前30 min給予葛花解酲方水煎劑(40 g/kg)灌胃，每天1次；對(duì)照組和模型組每天給予等量生理鹽水灌胃；葛花解酲方+LiCl組小鼠在葛花解酲方灌胃前30 min給予LiCl[1 mEq/(kg·d)]灌胃[9]，每天1次，其他三組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。共20周。

1.2.4標(biāo)本采集及處理 20周結(jié)束時(shí)，每組取10只小鼠脫臼處死，立即取小鼠肝臟用于測(cè)定肝臟重量、肝臟指數(shù)和Western blot檢查；每組另取10只小鼠，脫臼處死后取肝臟組織于多聚甲醛中固定24 h，用于HE染色和免疫組化染色。

1.2.5肝臟重量和肝臟指數(shù)測(cè)定 將10只小鼠處死前稱重，處死后立即取肝臟組織稱重，計(jì)算各小鼠肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝臟重量/小鼠體重(mg/g)。

1.2.6HE染色觀察肝臟病理學(xué)變化 石蠟包埋多聚甲醛固定的肝臟組織，切成5 μm切片，經(jīng)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，乙醇分色5 s，氨水返藍(lán)20 s，伊紅染色3 min，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.7免疫組化染色測(cè)定肝臟GST-Pi和PCNA表達(dá) 將石蠟切片置入烤箱中烤片1 h，經(jīng)脫蠟至水，放入枸櫞酸鈉緩沖液中修復(fù)10 min，加入過(guò)氧化氫封閉10 min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，加入抗原封閉液封閉30 min，加入一抗：兔抗鼠GST-Pi單克隆抗體(1∶200)、兔抗鼠PCNA單克隆抗體(1∶200)過(guò)夜孵育，加入抗兔二抗孵育30 min，DAB顯色10 min，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照用PBS代替。細(xì)胞核或細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，GST-Pi主要分布在肝細(xì)胞漿中，PCNA主要分布在肝細(xì)胞核中。每張切片拍攝5個(gè)高倍視野(400倍)，采用Image-Pro-plus6.0圖像分析軟件測(cè)定GST-Pi和PCNA的積分光密度(IOD)。

1.2.8Western blot測(cè)定肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平 將肝臟組織勻漿，提取肝組織總蛋白，采用BCA測(cè)定肝組織蛋白濃度和含量，每孔上樣量20 μg，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉，加入一抗：兔抗鼠Wnt-1多克隆抗體(1∶1 000)、兔抗鼠β-catenin多克隆抗體(1∶1 000)過(guò)夜孵育，以β-actin為內(nèi)參照，加入二抗孵育1 h，顯色液顯色，采用Quantity One軟件分析條帶亮度，肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平以Wnt-1、β-catenin條帶灰度值/β-actenin條帶灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肝臟重量、肝臟指數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟重量和肝臟指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較， 葛花解酲方組小鼠肝臟重量和肝臟指數(shù)降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟重量和肝臟指數(shù)升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

GroupsnLiverweight(g)Liverindex(mg/g)Controlgroup101.358±0.02345.21±1.34Modelgroup101.542±0.0191)60.47±1.421)GehuaJiechenggroup101.411±0.0211)2)49.53±1.461)2)GehuaJiecheng+LiClgroup101.478±0.0221)2)3)54.37±1.391)2)3)F141.067218.290P0.0000.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the Model group,2)P<0.05；compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

2.2各組小鼠肝臟HE染色情況 對(duì)照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)和形態(tài)正常，有完整的匯管區(qū)和肝小葉；模型組小鼠肝細(xì)胞變質(zhì)和結(jié)節(jié)性增生明顯，可見(jiàn)典型的假小葉，肝細(xì)胞變質(zhì)主要為小滴質(zhì)變、水腫、點(diǎn)狀壞死，增生肝細(xì)胞體積增大、核染色深，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維增生和膽管異常增生明顯，膽管上皮增生并具有異型性；葛花解酲方組小鼠肝細(xì)胞變質(zhì)、結(jié)節(jié)性增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管上皮增生及異型性較輕；葛花解酲方+LiCl組小鼠肝細(xì)胞變質(zhì)、結(jié)節(jié)性增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管上皮增生及異型性介于模型組和葛花解酲方組之間。見(jiàn)圖1。

2.3各組小鼠肝臟GST-Pi表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟GST-Pi IDO升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟GST-Pi IDO降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟GST-Pi IDO升高(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖2。

2.4各組小鼠肝臟PCNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟PCNA IDO升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟PCNA IDO降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟PCNA IDO升高(P<0.05)。見(jiàn)表3和圖3。

圖1 各組小鼠肝臟HE染色(×100)Fig.1 HE staining of liver in each group of mice(×100)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnGST-PiIDOControlgroup102135.42±1053.26Modelgroup1094724.53±1215.461)GehuaJiechenggroup10 4728.57±1164.381)2)GehuaJiecheng+LiClgroup10 6908.46±1179.321)2)3)F15261.374P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05；compared with the Model group,2)P<0.05；compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖2 各組小鼠肝臟GST-Pi免疫組化染色(×400)Fig.2 Immunohistochemical staining of liver GST-Pi in each group of mice(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnPCNAIDOControlgroup10483.14±142.15Modelgroup1021424.15±1861.321)GehuaJiechenggroup10 3152.15±1253.161)2)GehuaJiecheng+LiClgroup10 7463.17±1574.381)2)3)F460.914P0.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05;compared with the Model group,2)P<0.05;compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖3 各組小鼠肝臟PCNA IDO免疫組化染色(×400)Fig.3 Immunohistochemical staining of PCNA IDO in liver of each group of mice(×400)Note:A.Control group；B.Model group；C.Gehua Jiecheng；D.Gehua Jiecheng+LiCl group.

GroupsnWnt-1β-cateninControlgroup100.08±0.020.07±0.03Modelgroup100.82±0.111)0.64±0.091)GehuaJiechenggroup100.17±0.051)2)0.15±0.041)2)GehuaJiecheng+LiClgroup100.29±0.061)2)3)0.31±0.051)2)3)F236.129194.275P0.0000.000

Note：Compared with the Control group,1)P<0.05;compared with the Model group,2)P<0.05;compared with the Gehua Jiecheng group,3)P<0.05.

圖4 各組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白Western blot電泳圖Fig.4 Western blot analysis of Wnt-1 and β-catenin proteins in liver tissues of mice in each groupNote:1.Control group;2.Model group;3.Gehua Jiecheng group;4.Gehua Jiecheng+LiCl group.

2.5各組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)；與模型組比較，葛花解酲方組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)；與葛花解酲方組比較，葛花解酲方+LiCl組小鼠肝臟組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表4和圖4。

3 討論

肝癌前病變的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而緩慢的過(guò)程，癌前病變是癌癥啟動(dòng)、促進(jìn)和演變的中間階段，僅有少量細(xì)胞在特定條件下發(fā)生癌變，因此癌前病變過(guò)程是可逆的，是癌癥防治的重點(diǎn)。HBV感染可促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，我國(guó)大部分肝癌由HBV感染進(jìn)一步發(fā)展而來(lái)；我國(guó)酒精性肝損傷是繼肝炎后的第二大肝損傷原因。慢性肝病經(jīng)過(guò)癌前病變演變?yōu)楦伟┦嵌嗖襟E多階段的過(guò)程，其中細(xì)胞失控性生長(zhǎng)是惡性惡性腫瘤發(fā)生的生物學(xué)特征,細(xì)胞失控性生長(zhǎng)的主要分子機(jī)制為細(xì)胞增殖過(guò)度以及細(xì)胞凋亡減少[10]。GST-Pi是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶家族成員之一，是細(xì)胞抗癌變的重要解毒系統(tǒng)[11]，在多種惡性腫瘤中表達(dá)，在癌前狀態(tài)中表達(dá)升高，是癌癥啟動(dòng)細(xì)胞最早和最準(zhǔn)確的標(biāo)志酶，其表達(dá)數(shù)量和癌細(xì)胞的增殖多少關(guān)系密切[12,13]。PCNA和DNA合成關(guān)系密切，是DNA聚合酶輔助蛋白，在DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[14]；在細(xì)胞增殖后期G1期PCNA表達(dá)升高，在G1/S期交界時(shí)其表達(dá)達(dá)高峰，和細(xì)胞增殖關(guān)系密切[15]；在增殖活性旺盛的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，和惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16,17]。本研究通過(guò)建立乙醇性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌前病變模型，發(fā)現(xiàn)乙醇性HBV轉(zhuǎn)基因肝癌前病變小鼠中，肝臟重量、肝臟指數(shù)升高，肝細(xì)胞變質(zhì)和結(jié)節(jié)性增生明顯，可見(jiàn)典型的假小葉，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，膽管上皮增生并具有異型性，表明肝癌前病變小鼠模型建立成功；小鼠肝臟組織中GST-Pi和PCNA表達(dá)量升高，GST-Pi和PCNA表達(dá)量與癌前病變細(xì)胞增殖關(guān)系密切，表明肝癌前病變小鼠肝臟細(xì)胞存在異常增殖。

中醫(yī)無(wú)肝癌前病變之說(shuō)，根據(jù)肝癌前病變的病因病機(jī)，考慮類似于“肋痛”、“黃疸”、“積聚”、“臌脹”等范疇。肝癌前病變由多種致病因素共同作用的結(jié)果，病因包括：①內(nèi)因：陰陽(yáng)氣血虧虛、臟腑經(jīng)絡(luò)失調(diào)；②外因：傷食、六淫等邪毒郁積，從而導(dǎo)致邪毒縮聚成塊，形成癌瘤。葛花解酲方來(lái)自李東垣的《脾胃論》，具有減少肝細(xì)胞破壞、穩(wěn)定肝細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平、減輕肝損傷；減輕肝細(xì)胞變性壞死等作用，是治療酒精性肝病的良方。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)葛花解酲方對(duì)肝癌具有保護(hù)作用，如王鏡輝等[18]研究發(fā)現(xiàn)葛花解酲方通過(guò)抑制端粒酶蛋白表達(dá)、抑制細(xì)胞增殖對(duì)小鼠肝癌原位移植瘤發(fā)揮防治作用；李軍等[19]發(fā)現(xiàn)葛花解酲方可通過(guò)調(diào)節(jié)外周血中免疫炎癥因子含量改善小鼠的免疫功能，從而抑制小鼠移植性肝癌的生長(zhǎng)；郭斌等[20]發(fā)現(xiàn)葛花解酲方可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)逆轉(zhuǎn)肝癌癌前病變的發(fā)生，發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。本文對(duì)肝癌前病變小鼠給予葛花解酲方處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)葛花解酲方處理小鼠肝臟重量、肝臟指數(shù)、GST-Pi IDO、PCNA IDO降低；肝細(xì)胞變質(zhì)、結(jié)節(jié)性增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管上皮增生及異型性較輕。表明葛花解酲方可逆轉(zhuǎn)乙醇性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌前病變，其機(jī)制可能與葛花解酲方可降低GST-Pi和PCNA表達(dá)、抑制肝組織細(xì)胞增殖有關(guān)。

Wnt信號(hào)通路為一條多作用位點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的開(kāi)放通路，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，Wnt/β-catenin信號(hào)通路為典型的Wnt通路[21,22]；β-catenin為多功能細(xì)胞漿蛋白，其在機(jī)體處于疾病狀態(tài)下，因體內(nèi)環(huán)境的改變，游離的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖過(guò)程[23-25]。如RARα敲低通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制其下游靶標(biāo)PCNA、Ki67、MMP7和MMP9的表達(dá)抑制食道癌的增殖和轉(zhuǎn)移[26]；姜黃素通過(guò)抑制Wnt/β-catenin途徑抑制其下游細(xì)胞周期蛋白D1和PCNA的表達(dá)[27]。上述研究表明通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，且PCNA為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游基因，通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制其下游PCNA等細(xì)胞增殖相關(guān)因子，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。本文研究發(fā)現(xiàn)肝癌前病變小鼠肝組織中Wnt-1、β-catenin蛋白水平升高，給予葛花解酲方處理后肝組織Wnt-1、β-catenin蛋白水平降低，在給予葛花解酲方處理的同時(shí)給予Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑干預(yù)，則小鼠肝臟重量、肝臟指數(shù)、GST-Pi IDO、PCNA IDO、Wnt-1和β-catenin蛋白升高，可見(jiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路激動(dòng)劑對(duì)葛花解酲方對(duì)肝癌前病變的逆轉(zhuǎn)有阻止作用，表明葛花解酲方可能通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌前病變的進(jìn)展。

綜上所述，葛花解酲方可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低肝組織GST-Pi和PCNA表達(dá)，從而抑制肝細(xì)胞增殖、逆轉(zhuǎn)肝癌前病變過(guò)程。