付 璐 張 謙 楊 西 朱禹奇 宋思璇 張凌宇 張文慧 張林波

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長春 130118)

阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease,AD)是一種漸行性神經(jīng)退行疾病，患者表現(xiàn)為記憶力減退、認(rèn)知能力障礙、行為異常，最終將喪失獨(dú)立生活能力，在發(fā)病后的10～20年因并發(fā)癥死亡[1]。2018年，世界AD患者人數(shù)為5 000萬，預(yù)計到2050年，世界患病人口數(shù)將達(dá)到15 200萬[2]。然而目前沒有任何一種藥物能夠有效地延緩AD的疾病進(jìn)程[3]。研究表明，AD患者腦中有三大病理學(xué)特征：β淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)聚積形成的斑塊、高度磷酸化的微管結(jié)合蛋白聚集形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)和神經(jīng)元丟失[4]。其中，研究者普遍認(rèn)為患者腦中Aβ含量的異常升高是導(dǎo)致AD發(fā)病的最主要原因。因此，利用免疫療法清除腦中的Aβ是最具潛力治療AD的手段。

Aβ被動免疫療法是向體內(nèi)輸入Aβ特異性抗體，從而清除腦中過量的Aβ，以達(dá)到治療AD的目的。很多藥物研發(fā)公司進(jìn)行了臨床實驗[5]。如輝瑞和強(qiáng)生公司研發(fā)的Bapineuzumab，禮來公司研發(fā)的Solanezumab，都是以Aβ為靶點(diǎn)的抗體，臨床實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用Aβ特異性抗體能夠減少患者腦中Aβ的沉積，并對輕度AD患者的認(rèn)知功能有一定的改善[6-8]。而后，由百健公司開發(fā)的抗體BIIB037，在Ⅰ期臨床試驗中取得了較好的效果，目前正在準(zhǔn)備進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗[9]；由百健和衛(wèi)材公司一同研制的BAN2401，也在長達(dá)18個月的Ⅱ期臨床試驗中取得了較好的治療效果[10]。這些實驗結(jié)果都顯示出了Aβ被動免疫療法的治療潛力。雖然Aβ被動免疫療法已經(jīng)取得了一定的治療效果，但是由于全抗體存在抗體恒定區(qū)片段，易引發(fā)炎癥反應(yīng)，全抗體在AD治療領(lǐng)域中的應(yīng)用依舊存在安全性問題。

單鏈抗體(single chain fragment variable，scFv)是一種基因工程抗體，其只含有抗體重鏈以及輕鏈的可變區(qū)，并通過柔性鉸鏈相連接[11]。對于AD的治療，scFv顯示出了極大的優(yōu)勢。首先，由于scFv相對分子質(zhì)量較小，其能夠更好地透過血腦屏障，顯著提高治療效果；此外，scFv能夠更好地靠近腦中Aβ沉積，高效率地封閉Aβ的致病形式，有更高的治療效率[12]。更重要的是，由于scFv不含有全抗體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)，不能夠引起補(bǔ)體反應(yīng)，也不會激活腦中的免疫細(xì)胞，降低引起腦部炎癥反應(yīng)的可能，提高抗體治療的安全性[13]。因此，單鏈抗體在AD治療領(lǐng)域的應(yīng)用，顯示出了極大的優(yōu)勢。

本研究設(shè)計并成功制備了靶向Aβ的單鏈抗體，并對其體外活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該單鏈抗體能夠很好地與各種形式的Aβ相結(jié)合，具有良好的生物學(xué)活性，為AD的被動免疫療法奠定了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 單鏈抗體基因合成于生工生物工程(上海)股份有限公司；載體pET20b質(zhì)粒、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院病原微生物與免疫團(tuán)隊提供；Aβ42多肽由上海吉爾生化合成；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶(TaKaRa公司)；質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；鎳柱柱料(GE公司)；6E10抗體(Covance公司)；Anti-His 單克隆抗體、AP 標(biāo)記鼠二抗(Jackson Immuno Rearch 公司)；小牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基、胰酶(Hyclone 公司)；免疫組化試劑盒(邁新生物科技有限公司)；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2方法

1.2.1scFv的表達(dá)與純化 查找PDB數(shù)據(jù)庫，獲得能夠識別Aβ3-7表位的抗體12B4(PDB ID:3IFP)的氨基酸序列，通過基因合成的方式，獲得12B4-scFv的基因片段，并將其構(gòu)建到pET20b表達(dá)質(zhì)粒上，獲得能夠表達(dá)scFv的重組質(zhì)粒pET20b-12B4-scFv。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，對scFv進(jìn)行表達(dá)與純化，獲得單鏈抗體12B4-scFv。

1.2.2Aβ寡聚體與Aβ纖維的制備 將Aβ42多肽溶解于六氟異丙醇中，避光溶解至溶液澄清。在室溫條件下將六氟異丙醇揮發(fā)完全。用DMSO將Aβ42多肽完全溶解后，加入F12培養(yǎng)基，渦旋形成多肽懸液。將多肽懸液在4℃ 孵育24 h 后，獲得Aβ寡聚體；將多肽懸液在37℃ 孵育24 h后，獲得Aβ纖維，樣品置于-80℃ 冰箱備用。

1.2.3ELISA法檢測scFv對不同聚集形式Aβ的結(jié)合活性 在ELISA板中包被Aβ42多肽單體、Aβ寡聚體以及Aβ纖維，每孔100 ng，4℃包被過夜。包被完成后，洗去包被物質(zhì)，在37℃下封閉2 h。封閉后，將單鏈抗體從1∶1 000起，5倍稀釋至1∶125 000，加入到孔板中，37℃ 孵育2 h。隨后加入抗His單克隆抗體，37℃ 孵育2 h。然后進(jìn)行二抗孵育與顯色，并利用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果。樣品OD值高于背景值2倍視為陽性結(jié)果。

1.2.4Western blot法檢測scFv對Aβ寡聚體形成的抑制作用 在上述制備Aβ寡聚體的過程中，加入scFv，4℃孵育24 h 后，收取樣品，進(jìn)行Western blot實驗。首先利用SDS-PAGE對樣品進(jìn)行電泳分離，然后利用電泳半干轉(zhuǎn)化儀，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。牛奶溶液封后，利用Aβ特異性抗體6E10抗體進(jìn)行孵育，2 h 后，進(jìn)行二抗與顯色。

1.2.5硫黃素-T熒光法檢測scFv對Aβ纖維形成的抑制作用 采用硫磺素T(THT)法檢測scFv對Aβ纖維形成的抑制作用。將THT溶液加入到Aβ儲備液中。并向其中加入純化后的scFv，至總體積150 μl，混勻后加入孔板中。將孔板置于37℃中進(jìn)行反應(yīng)，每30 min利用熒光酶標(biāo)儀對熒光進(jìn)行檢測，激發(fā)波長425 nm，發(fā)射波長460 nm，并繪制纖維生長曲線。

1.2.6MTT法檢測scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用 將SH-SY5Y鋪于 96 孔板中，每孔約 5×104個細(xì)胞。37℃培養(yǎng)24 h后，向孔中分別加入空培養(yǎng)基(陰性對照組)、寡聚體(實驗對照組)或寡聚體和抗體混合物(實驗組)。37℃孵育48 h 后，向孔板中加入MTT，37℃ 孵育4 h。然后將孔板離心后棄去孔中上清。向每孔加入150 μl DMSO，充分振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測吸光度。

1.2.7免疫組化法檢測scFv對AD模型小鼠腦中Aβ斑塊的結(jié)合能力 取9月齡 APP/PS1 AD模型小鼠大腦，多聚甲醛固定后，脫水、透蠟、并進(jìn)行石蠟包埋與切片。將切片進(jìn)行高壓抗原修復(fù)后封閉，以12B4-scFv為一抗進(jìn)行孵育，然后以anti-His單克隆抗體為二抗進(jìn)行孵育，滴加適量酶標(biāo)抗體于切片上，孵育后顯色。復(fù)染、脫水、透明后封片，鏡檢照相。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較采用t-Test分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1scFv的構(gòu)建、表達(dá)與純化 我們成功將12B4-scFv的基因序列構(gòu)建到pET20b質(zhì)粒上，并用大腸桿菌對12B4-scFv進(jìn)行表達(dá)。利用鎳柱親和層析法，對scFv進(jìn)行了純化。實驗結(jié)果表明，12B4-scFv能夠很好地表達(dá)，經(jīng)過純化，能夠獲得純度達(dá)95%以上的蛋白。12B4-scFv的SDS-PAGE與Anti-his Western blot結(jié)果如圖1 所示。

2.2scFv能夠與不同聚集形式Aβ相結(jié)合 我們通過ELISA的方式對純化所得12B4-scFv與Aβ多肽、Aβ寡聚體以及Aβ纖維的結(jié)合活性進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖2所示。12B4-scFv能夠很好地與3種不同形式的Aβ相結(jié)合，其效價能夠達(dá)到105。其中，抗體與Aβ多肽的結(jié)合能力最強(qiáng)，與Aβ纖維的結(jié)合能力最弱。這可能是由于12B4-scFv識別的是Aβ3-7，Aβ在聚集形成寡聚體或者纖維后，其N端暴露部分減少，導(dǎo)致抗體的結(jié)合能力減弱。

2.3scFv對Aβ寡聚體和纖維的形成具有抑制作用 我們首先通過Western blot 的方式檢測了制備Aβ寡聚體，其分子量大小約為16 kD。在寡聚體制備過程中，加入12B4-scFv共同孵育，能夠顯著減少Aβ寡聚體的含量(圖3A)。

圖1 12B4-scFv的表達(dá)純化圖Fig.1 Purification of 12B4-scFv

THT能夠與β折疊結(jié)構(gòu)相結(jié)合，在激發(fā)光存在的情況下，發(fā)出熒光。在Aβ形成纖維的過程中，會產(chǎn)生大量β折疊結(jié)構(gòu)，因此Aβ纖維能夠與THT結(jié)合，并通過檢測熒光的強(qiáng)度來檢測Aβ纖維的形成情況。我們在制備Aβ纖維的過程中，加入12B4-scFv，檢測抗體對Aβ纖維形成的抑制作用。實驗結(jié)果如圖3B所示，12B4-scFv的加入能夠抑制Aβ纖維的形成，減少Aβ纖維的生成量，并能夠減慢Aβ纖維形成的速率，與未加入抗體的對照組相比，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.4scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性起到保護(hù)作用 我們利用SH-SY5Y細(xì)胞為模型，通過MTT法檢測了Aβ寡聚體對PC12細(xì)胞的毒性以及12B4-scFv對細(xì)胞的保護(hù)作用。實驗結(jié)果如圖4所示。與對照組相比，12B4-scFv能夠抑制Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，12B4-scFv的加入可以有效地保護(hù)細(xì)胞，當(dāng)加入抗體的量為0.1 mol/L時，其對細(xì)胞的保護(hù)效率能夠達(dá)到50%(P<0.01)。

圖2 ELISA法檢測12B4-scFv與不同形式Aβ的結(jié)合活性Fig.2 ELISA assay to determine binding activity of 12B4-scFv to different forms of Aβ

圖3 12B4-scFv對Aβ寡聚體與纖維形成的抑制作用Fig.3 Inhibition on formation of Aβ oligomers and fibers by 12B4-scFvNote:A.Western blot assay to determine the inhibitory effect of 12B4-scFv against the formation of Aβ oligomer;B.THT method was used to detect the inhibition of 12B4-scFv on the formation of Aβ fibers.

圖4 12B4-scFv對Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性的保護(hù)作用Fig.4 Protective effect of 12B4-scFv on cytotoxicity induced by Aβ oligomerNote:**.P<0.01.

圖5 12B4-scFv與AD模型鼠腦中Aβ斑塊的結(jié)合作用Fig.5 12B4-scFv bind to Aβ plaques in brain of AD model mice

2.5scFv能夠與AD模型小鼠腦中Aβ斑塊結(jié)合 我們?nèi)?月齡 APP/PS1 AD模型小鼠的腦組織，并制備組織切片。以12B4-scFv為一抗，anti-His單克隆抗體為二抗，進(jìn)行免疫組化實驗。結(jié)果如圖5所示。12B4-scFv能夠與AD模型鼠腦中海馬區(qū)Aβ斑塊相結(jié)合，具有治療潛力。

3 討論

AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且至今未明確，目前尚無一種有效的治療手段能夠延緩AD的疾病進(jìn)程[3]。淀粉級聯(lián)假說指出，Aβ在腦中的異常分泌和產(chǎn)生過多，使其在腦組織內(nèi)沉積，對周圍的突觸和神經(jīng)元具有毒性作用，可破壞突觸膜，最終引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]。Aβ的沉積還會導(dǎo)致AD的其他病理變化，如微管結(jié)合蛋白的過度磷酸化等，是AD發(fā)病的核心環(huán)節(jié)[15]。減少Aβ的形成，抑制Aβ的沉積，是最可能治療AD的有效途徑。

在過去的十幾年中，Aβ免疫療法逐漸發(fā)展起來。AN1792是第一個進(jìn)入臨床的AD主動免疫療法，其以全長的Aβ42為免疫原進(jìn)行了臨床試驗，但不幸的是這種主動免疫會引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致6%的受試者產(chǎn)生了腦膜腦炎反應(yīng)，最終該臨床實驗因安全性問題而失敗[16]。雖然臨床試驗以失敗告終，但結(jié)果顯示，相比于對照組，Aβ的免疫治療能夠減少患者腦中Aβ沉積，并改善生活障礙。因此，如果能夠避免主動免疫的副作用，Aβ免疫療法依舊充滿希望[17，18]。此后，以Aβ為靶點(diǎn)的被動免疫療法發(fā)展起來，直接向人體注射靶向不同Aβ形式的抗體，具有靶點(diǎn)精確，起效快速，副作用小等特點(diǎn)。很多以Aβ為靶點(diǎn)的被動免疫療法進(jìn)入了臨床試驗，并取得了一定的治療效果[19]。但是由于全抗體存在抗體恒定區(qū)片段，易引發(fā)炎癥反應(yīng)，并且具有分子量較大、血腦屏障透過率低等缺點(diǎn)，其在AD的治療領(lǐng)域中的應(yīng)用依舊存在安全性與有效性的問題。scFv由于其分子量小，不含有恒定區(qū)片段，大大增加了抗體治療的安全性與有效性，成為AD被動免疫治療的新方向[20]。

本研究在Aβ免疫療法的基礎(chǔ)上，對靶向Aβ3-7的抗體12B4進(jìn)行了改造，成功表達(dá)純化了其12B4-scFv。該scFv能夠與Aβ單體、寡聚體、纖維很好地結(jié)合，并能夠有效抑制Aβ寡聚體與纖維的形成。此外，該scFv還能抑制Aβ寡聚體產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，能夠與AD模型鼠腦中產(chǎn)生的斑塊相結(jié)合，具有非常好的體外活性。12B4-scFv避免了Aβ免疫療法目前存在的安全性與有效性的問題。此外，其體外功能的研究更揭示了抗體清除體內(nèi)Aβ的作用機(jī)制。在下一步的實驗中，我們將會利用12B4-scFv對不同年齡段的AD模型鼠進(jìn)行治療，進(jìn)一步探究12B4-scFv對AD模型小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，為阿爾茨海默癥的新型抗體療法奠定基礎(chǔ)。