鄭 興 吳兆紅 陳崗東 王戈菲 潘有光 (廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院心胸外科，廣州 510150)

肺癌是臨床上常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，其死亡率在所有類(lèi)型的惡性腫瘤中高居榜首，5年生存率僅為15%左右[1]。肺癌的主要病理類(lèi)型為小細(xì)胞肺癌(small lung cancer，SLC)和非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中非小細(xì)胞肺癌約占總發(fā)病率的85%[2]。非小細(xì)胞肺癌發(fā)病隱匿，易發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究已成為非小細(xì)胞肺癌早期診斷和臨床治療的重中之重。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于動(dòng)植物中的一類(lèi)具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，全長(zhǎng)約為18～25個(gè)核苷酸，主要通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)的形式與其靶基因的3′非編碼區(qū)結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)靶基因的降解或抑制靶基因的翻譯[3]。研究顯示，miR-27a在乳腺癌、胃癌、腎癌、肝癌、食管癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，并密切參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等病理生理過(guò)程[4,5]。本研究旨在探究miR-27a在非小細(xì)胞肺癌中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，30只SPF級(jí)，7周齡，體重(20～22)g的BALB/c雄性裸鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。plenti-GFP空載和plenti-GFP-miR-27a慢病毒載體由上海吉瑪制藥技術(shù)公司構(gòu)建，GOLM1-WT和GOLM1-Mut熒光素酶報(bào)告載體由深圳市盎然生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。PEG8000、嘌呤霉素均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。GOLM1兔單克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，Dual-Luciferase?Reporter Assay System熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。Transwell細(xì)胞小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1miR-27a慢病毒包裝及穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建 plenti-GFP空載或plenti-GFP-miR-27a慢病毒載體分別與包裝質(zhì)粒pMD2.0G和pAXAS2共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染48 h、60 h、72 h時(shí)分別收集細(xì)胞上清病毒溶液。將收集所得病毒溶液合并，將病毒上清與PEG8000以30∶7.5的比例進(jìn)行混合，4℃靜置過(guò)夜。4 000 g離心20 min，棄上清，病毒沉淀用RPMI1640培養(yǎng)基重懸。隨后將病毒加入到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549中，感染48 h后，用1 μg/ml的嘌呤霉素篩選未感染細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，待細(xì)胞全部表達(dá)綠色熒光時(shí)表明慢病毒穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建成功。構(gòu)建成功細(xì)胞系分別為miR-27a NC組和miR-27a OE組。

1.2.2熒光素酶分析miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系 根據(jù)miRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測(cè)miR-27a可能的靶基因?yàn)镚OLM1，并分析miR-27a與GOLM1之間的作用片段序列。設(shè)計(jì)野生型GOLM1-3′-UTR(GOLM1-WT)及缺失miR-27a結(jié)合區(qū)域的突變體GOLM1-3′-UTR(GOLM1-Mut)序列，并構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體。將GOLM1-WT和GOLM1-Mut分別轉(zhuǎn)染miR-27a NC和miR-27a OE細(xì)胞系，48 h后采用熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞熒光素酶活性，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3Western blot檢測(cè)GOLM1蛋白表達(dá)水平 收集miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞1×106個(gè)，加入100 μl 1×SDS Loading buffer，沸水浴中煮沸10 min，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的GOLM1兔單克隆抗體(1∶5 000),4℃孵育過(guò)夜。次日PBST洗滌6 min，重復(fù)3次，然后加入封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫孵育60 min，PBST洗滌6 min，重復(fù)3次，ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml，以每孔100 μl的量接種于96孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)12 h至細(xì)胞貼壁。每孔分別于24、36、48和72 h時(shí)加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，在450 nm處測(cè)定各孔吸光度值。每組細(xì)胞每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.2.5Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml，以每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于Transwell上室，下室加入500 μl RPMI1640完全培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后，PBS漂洗2次，多聚甲醛固定20 min，用棉簽輕輕擦掉上室未侵襲的細(xì)胞。結(jié)晶紫染色5 min，自來(lái)水沖洗結(jié)晶紫染料，適當(dāng)風(fēng)干Transwel膜，顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)并分析兩組細(xì)胞的侵襲個(gè)數(shù)。

1.2.6TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞用胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml，以每孔100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。PBS洗滌1次，用含0.3%TritonX-100的PBS室溫孵育5 min，PBS洗滌2次，加入50 μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次，抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡下觀察染色效果。

1.2.7體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)分析小鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移情況 miR-27a NC組、miR-27a OE組以及未轉(zhuǎn)染Control組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549細(xì)胞重懸于PBS并調(diào)整濃度至5×107個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞懸液接種于BALB/c裸鼠腋下脂肪墊，于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)，每天觀察并記錄各組小鼠皮下腫瘤的生長(zhǎng)狀況，32 d后處死小鼠并解剖腹腔，顯微鏡下觀察腹膜內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。腫瘤體積(V)= 0.52×長(zhǎng)×寬2。

2 結(jié)果

2.1miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系的驗(yàn)證 通過(guò)生物信息學(xué)在線預(yù)測(cè)軟件分析miR-27a可能的作用靶點(diǎn)為GOLM1，miR-27a與GOLM1 mRNA 3′UTR區(qū)的互補(bǔ)序列見(jiàn)圖1A。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染GOLM1-WT的miR-27a NC組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染GOLM1-WT的miR-27a OE組細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染GOLM1-Mut后的miR-27a NC組和miR-27a OE組細(xì)胞的熒光素酶相對(duì)活性無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1B。表明GOLM1是miR-27a的作用靶點(diǎn)。

圖1 miR-27a與GOLM1靶向關(guān)系的驗(yàn)證Fig.1 Verification of miR-27a and GOLM1 targeting relationshipNote:Compared with the miR-27a NC group in GOLM1-WT,*.P<0.05.

2.2miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)GOLM1蛋白水平的影響 Control組、miR-27a NC組和miR-27a OE組細(xì)胞的GOLM1蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為1.35±0.08、1.31±0.09和0.54±0.05。與Control組和miR-27a NC組相比，miR-27a OE組細(xì)胞GOLM1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Control組和miR-27a NC組細(xì)胞GOLM1的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。表明miR-27a可負(fù)向調(diào)控GOLM1的表達(dá)。

圖2 miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)GOLM1蛋白水平的影響Fig.2 Effect of miR-27a overexpression on GOLM1 protein

2.3miR-27a 對(duì)A549細(xì)胞增殖活力的影響 與Control組和miR-27a NC組相比，在24、36、48和72 h四個(gè)時(shí)間段miR-27a OE組細(xì)胞的增殖活力均受到顯著的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Control組和miR-27a NC組細(xì)胞增殖活力差異無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 miR-27a 過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖活力的影響Fig.3 Effect of miR-27a overexpression on proliferation of A549 cells

2.4miR-27a對(duì)A549細(xì)胞侵襲能力的影響 為了進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-27a對(duì)A549體外轉(zhuǎn)移的影響，采用Transwell檢測(cè)A549過(guò)表達(dá)miR-27a后細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果顯示，與Control組(80.26±8.03)個(gè)和miR-27a NC組(77.51±10.18)個(gè)相比，miR-27a OE組(39.66±5.74)細(xì)胞的侵襲能力受到顯著的抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 miR-27a 過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響Fig.4 Effect of miR-27a overexpression on invasive ability of A549 cells

2.5miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，與Control組(49.17±6.56)個(gè)和miR-27a NC組(44.84±7.01)個(gè)相比，miR-27a OE組(82.49±9.70)個(gè)細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 miR-27a 過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-27a overexpression on apoptosis of A549 cells

2.6miR-27a 過(guò)表達(dá)對(duì)裸鼠皮下移植瘤的影響 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-27a OE組腫瘤生長(zhǎng)速度顯著低于Control組和miR-27a NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-27a OE組小鼠體內(nèi)成瘤后腹膜內(nèi)的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)量(8.85±1.57)也顯著低于Control組(14.25±3.04)和miR-27a NC組(14.69±2.73)小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 裸鼠皮下移植瘤體積比較Fig.6 Comparison of subcutaneous transplantation tumor volume

3 討論

高爾基體膜蛋白(golgi membrance protein 1，GOLM1)又稱(chēng)GOLPH2和GP73，是一種定位于高爾基體順面囊膜的Ⅱ型高爾基體膜糖蛋白[6]。GOLM1的表達(dá)具有上皮細(xì)胞特異性，在膽管、肝、腎、腸、前列腺等上皮細(xì)胞中發(fā)揮多種功能，是維系正常細(xì)胞功能和內(nèi)臟器官生長(zhǎng)發(fā)育的重要蛋白[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)GOLM1在肝癌、腎癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[9,10]。最新的研究表明GOLM1在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)，密切參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并與患者的不良特征密切相關(guān)[11-13]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GOLM1的3′UTR區(qū)存在miR-27a的多個(gè)堿基結(jié)合位點(diǎn)，可能是miR-27a的作用靶點(diǎn)，因此我們采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了GOLM1是miR-27a的下游靶基因，提示miR-27a可能通過(guò)靶向GOLM1的mRNA進(jìn)而調(diào)控其蛋白表達(dá)。Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示過(guò)表達(dá)miR-27a可顯著下調(diào)GOLM1的蛋白表達(dá)水平。綜合以上結(jié)果，我們推測(cè)miR-27a靶向調(diào)控GOLM1基因可能在非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生于發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

研究顯示miR-27a在乳腺癌、食管癌、惡性膠質(zhì)瘤、肝癌等不同惡性腫瘤中可與多個(gè)靶基因結(jié)合從而發(fā)揮其促癌或抑癌功能[14,15]。如miR-27a可通過(guò)抑制MXI1或PHB的表達(dá)而促進(jìn)或抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[16,17]。目前尚未有研究報(bào)道m(xù)iR-27a對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物行為學(xué)的影響。為了進(jìn)一步闡明miR-27a在非小細(xì)胞肺癌中的發(fā)病機(jī)制，我們通過(guò)構(gòu)建miR-27a過(guò)表達(dá)A549穩(wěn)定細(xì)胞系，檢測(cè)miR-27a過(guò)表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。結(jié)果顯示，miR-27a過(guò)表達(dá)后，細(xì)胞增殖活力和侵襲能力均受到顯著抑制，細(xì)胞凋亡率則明顯增加。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明miR-27a過(guò)表達(dá)的裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)速度及其腹膜內(nèi)轉(zhuǎn)移病灶水平均顯著低于對(duì)照組，提示過(guò)表達(dá)miR-27a可抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究綜合細(xì)胞水平和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)證明了miR-27a可通過(guò)下調(diào)GOLM1的蛋白表達(dá)，抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，有望為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的思路。但需要注意的是可能還存在其他靶基因受miR-27a的調(diào)控，進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展，這些工作還需未來(lái)更加深入的研究和探索。