張 杰 李玉嬌 張峰波 孔慧芳 周曉濤 王紅英 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

包蟲病(hydatid disease)又稱棘球蚴病，為自然疫源性疾病，是一種嚴重危害健康的人獸共患寄生蟲病，呈世界性分布和流行[1，2]。以細粒棘球絳蟲(echinococcus granulosus,Eg)的幼蟲引起的稱囊性包蟲病(cystic echinococcosis,CE)或稱囊性棘球蚴病，以多房棘球絳蟲幼蟲(echinococeosis multilo-cularis，Em)感染所引起的稱泡型包蟲病(alveolar echinococcosis,AE)[2，3]。我國包蟲病的高發(fā)區(qū)主要以青海、新疆、西藏、寧夏、內(nèi)蒙古、四川、甘肅等地，其主要寄生在肝肺等重要器官，嚴重危害人體健康和畜牧業(yè)發(fā)展[4，5]。目前針對包蟲病的治療以手術(shù)輔以藥物治療為主，但控制的仍不理想，因此采取免疫預(yù)防是較為經(jīng)濟有效的方法，但我們?nèi)绾握业接行У囊呙缡乾F(xiàn)在科學(xué)界迫在眉睫問題。近幾年多價疫苗的研究已是許多感染性疾病如包蟲疫苗的熱點課題[6，7]。傅玉才等[8]研究發(fā)現(xiàn)EgA31抗原在動物模型試驗中刺激機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，可作為理想的包蟲疫苗候選分子。為研究出更加經(jīng)濟有效的包蟲病疫苗，曹春寶等[9]在細粒棘球蚴中發(fā)現(xiàn)了新基因—EgG1Y162抗原基因，研究發(fā)現(xiàn) EgG1Y162蛋白能刺激宿主體內(nèi)的免疫反應(yīng)，因此EgG1Y162抗原被認為是一種理想的疫苗候選分子[10，11]。為了提高疫苗的有效性，將多個抗原進行聯(lián)合構(gòu)成多價疫苗，較單價疫苗能更好的誘導(dǎo)宿主的免疫保護作用[12]。

本研究將EgA31抗原基因與EgG1y162抗原基因通過linker序列鏈接，將其融合抗原序列進行優(yōu)化，構(gòu)建原核表達系統(tǒng)，提高體外融合蛋白的表達。通過生物信息學(xué)方法分析優(yōu)化抗原基因序列、密碼子、抗原表位等，為后期構(gòu)建理想的蛋白疫苗和DNA疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1EgG1Y162蛋白基因序列的獲取 根據(jù)曹春寶等[9]構(gòu)建的 EgG1Y162 重組蛋白，去除信號肽的基因cds序列為360 bp(GeneBank登錄號：AB458259)。

1.1.2EgA31蛋白基因序列的獲取 (GeneBank登記號為：AF067807),其氨基酸序列(GenBank登記號為:AAC21558.1)全長序列1 836 bp，編碼氨基酸為601個。根據(jù)課題組成員前期分析預(yù)測的該抗原表位預(yù)測結(jié)果，選擇優(yōu)勢的易形成抗原表位的氨基酸序列為201～534，全長1 002 bp，編碼334個氨基酸。

1.1.3EgA31-EgG1Y162氨基酸獲取 通過登錄GeneBank得到蛋白氨基酸序列。

1.1.4EaA31-EgG1Y162抗原密碼分析 運用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1在線軟件分析EgA31-EgG1Y162序列 優(yōu)化前后密碼子使用度。

1.1.5試劑 構(gòu)建成功的Pet30a-EgG1Y162-EgA31 原核表達質(zhì)粒，IPTG誘導(dǎo)劑，大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受態(tài)細胞,卡那霉素，LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉 )，SDS-PAGE蛋白凝膠試劑盒，蛋白marker,考馬斯亮藍染色液，脫色液，凝膠成像儀,37℃恒溫培養(yǎng)箱，搖床。

1.2方法

1.2.1重組抗原基因 抗原基因cds序列EgA31-EgG1Y162進行重組構(gòu)建，為后期蛋白的有效的表達。

1.2.2EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性質(zhì)分析 使用Expasy在線軟件ProtParam[13](http://web.expasy.org/protparam/)分析EgA31-EgG1Y162 蛋白的理化性質(zhì)特點。

1.2.3EgA31-EgG1Y162蛋白二級結(jié)構(gòu) 使用DNAstar軟件的protean的模塊對截短序列EGA31蛋白，EgG1Y162蛋白及聯(lián)合蛋白EgA31-EgG1Y162蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，比較單獨的兩個序列用link連接后結(jié)構(gòu)有無發(fā)生改變。

1.2.4EgA31-EgG1Y162蛋白二級結(jié)構(gòu)分析 運用在線軟件SOMPA[14](https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析EgA31-EgG1Y162蛋白的二級結(jié)構(gòu)：α-螺旋，β-折疊，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲進行分析。

1.2.5EgA31-EgG1Y162抗原DNA序列對比 運用DNAStar軟件的Blast模塊將優(yōu)化前后的序列進行DNA序列比對，比較兩者序列中堿基的變化情況。

1.2.6EgA31-EgG1Y162蛋白的密碼分析 運用在線軟件E.coli Codon Usage Analyzer 2.1[15]分析序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)。

1.2.7EgA31-EgG1Y162蛋白T細胞表位分析運用在線軟SYFPEITHI[16](http://www.syfpeithi.de/bin/mhcserver.dll/epitopeprediction.htm)、運用在線軟件 IEDB[16](http://tools.iedb.org/mhcii/)參數(shù)選擇HLA-DRB1*0701，分析聯(lián)合抗原EgA31-eGgay162的T細胞優(yōu)勢抗原表位。

1.2.8EgA31-EgG1Y162蛋白B細胞表位分析 運用在線軟件ABCpred[17](http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/ABC_submission.html)、BepiPred-1.0[18](http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred-1.0/)分析融合蛋白EgA31-EgG1Y162的B細胞優(yōu)勢抗原表位。

1.2.9EgA31-EgG1Y162蛋白誘導(dǎo)表達 原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細胞培養(yǎng)過夜，挑陽性單菌落搖菌培養(yǎng)過夜，按1∶100接種種子菌液至液體培養(yǎng)基中，220 r/min 37℃ 搖床培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時，經(jīng)IPTG體外誘導(dǎo)蛋白表達，3 000 r/min離心15 min 4℃收集菌體沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10EgA31-EgG1Y162蛋白樣品的制備 蛋白樣品的獲?。?%的SDS溶解菌體沉淀,4℃ 300 W，間隔5 s、超聲5 s、超聲2 min，12 000 r/min離心5 min 4℃，收集上清。按1∶3加入4×蛋白上樣緩沖液,沸水煮10 min,使蛋白質(zhì)變性，備用。

1.2.11SDS-PAGE電泳 配置12%的分離膠，5%的濃縮膠制備蛋白電泳凝膠，蛋白上樣10 μl,80 V 20 min濃縮膠，100 V 90 min分離膠條件下電泳,電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍色液室溫染色4 h，脫色3次，每次60 min,凝膠成像儀拍照看蛋白誘導(dǎo)表達結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1EgA31-EgG1Y162蛋白誘導(dǎo)表達 重組pET30a-EgA31-EgG1Y162原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)IPTG體外誘導(dǎo)蛋白表達，理論蛋白大小58 kD,圖1與預(yù)期理論結(jié)果一致,得出1～4，條件下誘導(dǎo)出的蛋白表達量均高。在IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 3 h的條件下，誘導(dǎo)的蛋白濃度與其他條件相比最高。

2.2EgA31-EgG1Y162蛋白的理化性質(zhì)的分析結(jié)果 使用ProtParam在線軟件分析EgA31- EgG1Y162蛋白有462個氨基酸組成，蛋白分子質(zhì)量為52 926.58 Daltons；理論pI值為6.51；含有78強堿性(+)氨基酸(K,R)；81 強酸性(-)氨基酸(D,E)；原子組C4072 h6757N1389O1638S335，不穩(wěn)定系數(shù)為40.17，歸類為不穩(wěn)定蛋白(大于40時，預(yù)測蛋白不穩(wěn)定)；平均親水系數(shù)GRAVY：-0.774(GRAVY值的范圍在-2到2之間，負值表明為親水性蛋白)歸類為親水性蛋白。

圖1 蛋白誘導(dǎo)表達 SDS-PAGE 結(jié)果Fig.1 Protein-induced expression SDS-PAGE resultsNote:M.Protein marker；1.IPTG 0.5mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 2 h;2.IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 3 h；3.IPTG 0.5 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 4 h；4.IPTG 0.2 mmol/L 28℃ 2 h 37℃ 2 h；5.Uninduced.

2.3EgA31-EgG1Y162抗原的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析 使用在線軟件SOPMA對EgA31-EgG1Y162抗原的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲二級結(jié)構(gòu)進行分析和預(yù)測。如下圖2藍色Hh表示α-螺旋，約占69.05%，紅色Ee表示β-折疊，約占10.17%，綠色Tt表示β-轉(zhuǎn)角約占5.63%,紫色Cc表示無規(guī)卷曲，約占15.15%。

2.4抗原優(yōu)化后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析和對比 運用DNAstar軟件的protein模塊中的Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析EgA31EgG1Y162蛋白(圖 3)，EgA31蛋白(圖4)的二級結(jié)構(gòu)EgG1Y162蛋白(圖5)，紅色表示為α-螺旋(alpha)，綠色表示為β-折(beta)，藍色表示為β-轉(zhuǎn)角(turn)，黃色表示為不規(guī)則卷(coil)。從預(yù)測的結(jié)果分析，多價EgA31-EgG1Y162蛋白的二級結(jié)構(gòu)與單獨的EgA31和EgG1Y162蛋白二級結(jié)構(gòu)比較，其α-螺旋，β-折疊(beta)區(qū)域基本無變化。β-轉(zhuǎn)角(turn)，不規(guī)則卷曲(coil)區(qū)域抗原指數(shù)增加，其linker連接部位的兩側(cè)指數(shù)增加指數(shù)較高。蛋白的親水性、蛋白抗原的表面可及性、抗原指數(shù)均在linker連接兩側(cè)有所增加

圖3 DNAstar分析EgA31-EgG1Y162蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.3 DNAstar analysis protein secondary structure

圖4 DNAstar分析EgA31蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.4 DNAstar analysis of EgA31 protein second-ary structure

圖5 DNAstar分析EgG1Y162蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.5 DNAstar analysis of EgG1Y16 protein protein secondary structure

2.5EgA31-EgG1y162 DNA序列優(yōu)化前后對比結(jié)果 運用DNAMAN軟件Blast模板比較EgA31-EgG1Y162 DNA序列在優(yōu)化前后的變化。優(yōu)化前后兩DNA序列的一致性為80.13%(圖6)。

未優(yōu)化序列的結(jié)果：SEQ未優(yōu)化序列:1 389 bp;Composition 553 A;223 C;297 G;316 T;0 OTHERPercentage:39.8% A;16.1% C;21.4% G;22.8% T;0.0%OTHER Molecular Weight(kD):ssDNA:431.31 dsDNA:856.14。

優(yōu)化后序列的結(jié)果：SEQ 優(yōu)化列.txt:1 389 bp;Composition 463 A;335 C;343 G;248 T; 0 OTHERPercentage:33.3% A;24.1% C;24.7% G;17.9% T;0.0%OTHER′Molecular Weight(kD):ssDNA:429.97 dsDNA:856.30。從序列比對的結(jié)果分析，優(yōu)化之后的DNA序列的ACG三種堿基比例改變，其中堿基A在優(yōu)化后較優(yōu)化前比例減少了6.5%，堿基G減少了4.9%，堿基C的含量增加了3.3%。

圖6 DNA序列的對比結(jié)果Fig.6 Comparison results of DNA sequenceNote:Dark blue is the same base of two sequences,and the rest are different base parts.

圖7 優(yōu)化序列密碼子分析結(jié)果Fig.7 Optimization sequence codon analysis resultsNote:Codon Adaptation Index(CAI)is 1.

圖8 未優(yōu)化序列的分析結(jié)果Fig.8 Analysis results of unoptimized sequencesNote:Red indicates a low utilization codon CAI<1.

圖9 左SYFPEITHI分析預(yù)測T表位，前十組右IEDB分析預(yù)測T表位前十Fig.9 Left SYFPEITHI analysis predicts T epitopes,top ten group Right IEDB analysis predicts top ten groups of T epitopesNote:On the left,the higher the score is the easier to form the epitope map.On the right,the lower the percentage is the easier to form an B epitope

表1 EgA31-EgG1y162抗原T和B細胞表位
Tab.1 EgA31-EgG1y162 antigen T and B cell epitopes

EpitopeMethodPositionAminoacidsequenceTcellepitopeSYFPEITHI,IEDB86-97KEKLQESETKLL1-15RRALITQESRNLELQ179-191LENLLKTETQELL305-319MRDTINTLTEKIATI359-378LPEHFRWIHVGSRSLELGWN344-358ELMAKLTKELKTTBcellepitopeABCpred、BepiPred102-112THDQTKRIHDV172-204TKEINTKLENLLKTETQELLTTIKDLDSKLTES394-409YVTFKYRNVP415-431LTLEGLKPSTFYEVVV443-458YGFIRTLAPGEDGADR318-334TIKIPEPLPMMKPIEIPK343-353VDPELMAKLTK

2.6序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)(CAI )分析結(jié)果 利用大腸桿菌對密碼子應(yīng)用的偏好性，運用在線軟件E.coli Codon Usage Analyzer 2.1分析優(yōu)化序列中密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI為1，且優(yōu)化序列的密碼子中不含利用率低的密碼子(圖7)。未優(yōu)化序列密碼子的分析結(jié)果(圖8)，未優(yōu)化的序列中含有利用率低的密碼子，數(shù)量為121個，密碼子適應(yīng)指數(shù)與優(yōu)化的序列相比小于優(yōu)化序列的CAI。

2.7融合抗原EgA31-EgG1Y162的表位分析結(jié)果 運用SYFPEITHI軟件和 IEDB 軟件選取前十組分值較高容易形成表位的氨基酸區(qū)域(圖9)綜合分析預(yù)測聯(lián)合抗原EgA31-EgG1Y162蛋白T細胞表位優(yōu)勢表位(1～15、86～97、179～191、359～388、305～319、344～358)。運用ABCpred、BepiPred軟件分析預(yù)測EgA31-EgG1Y162蛋白的B細胞表位，選擇分值較高的前十組，綜合分析預(yù)測易形成B細胞抗原表位的氨基酸區(qū)域(102～112、172～204、318～334、343～353、394～409、415～431、443～458)。表1預(yù)測分析出優(yōu)化EgA31-EgG1y162的抗原表位氨基酸序列，與前期課題組單獨分析預(yù)測EgA31抗原的T細胞表位(201～214、286～297、379～391、507～519)，B細胞抗原表位(302～312、372～404、518～534)，EgG1Y162抗原B細胞表位(9～17、63～73、77～82、109～117)，T細胞表位(6～14、17～36、63～83、106～116)相比，兩個序列用連接后所形成的表位氨基酸區(qū)域包括了單獨的EgA31及EgG1Y162蛋白分析預(yù)測的T、B細胞表位，其抗原表位未受到影響，聯(lián)合的抗原表位的氨基酸區(qū)域稍稍大于單獨分析的表位區(qū)域。

3 討論

目前人們對抗原誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)的機制有了更加深入的了解，不斷涌現(xiàn)出新型重組疫苗，如基因重組亞單位疫苗、重組活載體疫苗、重組缺失疫苗、重組蛋白疫苗，基因疫苗等[19,20]。在免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展中，人們克隆表達和分離純化完整的蛋白抗原，并利用完整的抗原來獲得相對應(yīng)的抗體，這種方法比較復(fù)雜，需浪費大量的人力、物力和財力。而表位疫苗的研究則避免了這一問題，是當前分子疫苗研究的熱點課題[21]，因此我們分析預(yù)測出免疫原性強的抗原表位，再將其聯(lián)合起來，從而使疫苗獲得較好免疫保護作用[22]。

本研究將融合抗原序列進行優(yōu)化構(gòu)建，誘導(dǎo)表達及鑒定顯示抗原優(yōu)化后的融合蛋白表達量高，通過生物信息學(xué)軟件對優(yōu)化后的融合抗原序列EgA31-EgG1Y162進行分析研究，蛋白分子質(zhì)量為52926.58 Daltons；發(fā)現(xiàn)該蛋白的原子組成為C4072 h6757N1389O1638S335，理論PI值為6.51，歸為不穩(wěn)定性蛋白且親水性蛋白，蛋白的親水性指數(shù)越大則形成表位的可能性越大。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要的化學(xué)鍵是氫鍵，其鍵能較高，從而使蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不易形成表位，分析該蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)α-螺旋，β-折疊比例較高，此結(jié)構(gòu)中含有氫鍵較多且位于蛋白內(nèi)側(cè)，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲大部分位于蛋白質(zhì)的外側(cè)與配體容易結(jié)合形成抗原表位[23]，因此具有潛在的抗原表位優(yōu)勢。

近年來，蛋白融合技術(shù)已得到廣泛的利用，其前提是進行基因融合。本研究linker序列是一段小分子短肽(GGGGSGGG)的柔性氨基酸，其中甘氨酸結(jié)構(gòu)簡單不易折疊，對蛋白的空間構(gòu)象影響小，由于它自身良好的柔韌性且伸展性好的特點，可使兩端序列的柔性不受影響，保持2種蛋白的正確折疊[24]。通過對融合蛋白和單獨的蛋白比較分析，融合蛋白的β-轉(zhuǎn)角區(qū)域、無規(guī)則卷曲區(qū)域指數(shù)增加，且融合蛋白的骨架柔韌性、抗原表面可及性、抗原指數(shù)也有所增加，指數(shù)增加最明顯的區(qū)域是linker序列連接的兩側(cè)的氨基酸殘基區(qū)域。這些指數(shù)的增加更有利于抗原表位的形成，應(yīng)用軟件對EgA31-EgG1Y162抗原表位預(yù)測分析出融合蛋白的抗原表位包括6個T表位和7個B表位，與單獨的EgA31和EgG1Y162抗原表位分析比較，抗原表位并未發(fā)生改變。linker序列作為一段柔性短肽，不僅未對兩端蛋白的正常折疊產(chǎn)生影響，而且增加了linker 序列兩側(cè)抗原表位的形成，其B表位(318-334)TIKIPEPLPMMKPIEIPK，(343-353)VDPELMAKLTK在linker序列兩側(cè)。Linker序列作為融合蛋白形式發(fā)揮作用，從而不僅保證了融合基因所表達蛋白的完整性并且使功能蛋白較好的穩(wěn)定性和生物活性，可促進融合蛋白的可溶性表達[25]。

研究發(fā)現(xiàn)[26]，不同宿主的蛋白表達對編碼氨基酸的遺傳密碼子有偏好性，編碼氨基酸時密碼子使用頻率并不完全相同的現(xiàn)象被稱為密碼子偏好性。由于密碼子具有兼并性的特點，編碼同一種氨基酸的不同密碼子稱同義密碼子[25]。經(jīng)研究大腸桿菌表達菌株偏好C/G結(jié)尾的密碼子，其常用偏愛的幾種密碼子中，以A堿基開頭，以C堿基結(jié)尾的密碼子較多，因此我們通過分析序列在優(yōu)化前后個別堿基含量發(fā)生改變。密碼子的偏愛對外源性蛋白的表達有重要的影響，可以提高外源基因在宿主細胞內(nèi)的蛋白表達[27]，我們對誘導(dǎo)出的蛋白進行鑒定發(fā)現(xiàn)融合蛋白有效表達。通過進一步運用E.coli Codon Usage Analyzer 2.1分析融合抗原序列優(yōu)化前后密碼子的適應(yīng)指數(shù)(CAI)[28]，其程度范圍在0～1，數(shù)值越大說明目的基因密碼子使用頻率與宿主中的差異越小，則反應(yīng)外源基因在宿主細胞內(nèi)蛋白表達量越高。通過密碼子適應(yīng)指數(shù)分析可知優(yōu)化序列中CAI的值為1，不含利用率低的密碼子，使優(yōu)化序列的基因在宿主細胞中誘導(dǎo)出表達量高的蛋白。未優(yōu)化的序列中則含有多個宿主細胞利用率低的密碼子，不能被宿主細胞高效利用，而影響目的基因的表達。通過抗原序列優(yōu)化，將目的基因中宿主細胞利用低的密碼子通過堿基替換為宿主細胞所偏愛的密碼子，以此提高目的蛋白表達水平[29]。

綜上所述，本研究融合了細粒棘球絳蟲不同階段的候選疫苗抗原EgA31-EgG1Y162，經(jīng)過序列優(yōu)化后，能提高其在體外誘導(dǎo)表達，并且運用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)該優(yōu)化序列的融合蛋白具有許多優(yōu)勢，這為進一步構(gòu)建保護性融合多價蛋白疫苗防控包蟲感染奠定了實驗基礎(chǔ)，為將來深入開展細粒棘球絳蟲終末宿主犬的多價表位疫苗研究提供新思路。