許 洋 張雅敏 王 建 楊 龍 劉子榮 (天津市第一中心醫(yī)院器官移植中心，天津 300192)

活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activated T cell,NFAT)最初作為與人T細(xì)胞中IL-2啟動(dòng)子的抗原受體應(yīng)答元件-2(ARRE-2)相結(jié)合的誘導(dǎo)型核因子被發(fā)現(xiàn)[1]。NFAT家族包括5名成員：NFATc1(也稱NFAT2)、NFATc2(NFAT1)、NFATc3(NFAT4)、NFATc4(NFAT3)和NFAT5，當(dāng)細(xì)胞受到信號(hào)刺激時(shí)，通過鈣離子/鈣調(diào)蛋白激酶信號(hào)通路，使 NFAT 蛋白迅速去磷酸化，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與 NFAT 靶基因上的位點(diǎn)結(jié)合發(fā)揮其介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。NFAT信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)與腫瘤惡性表型和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，其已顯示出在調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，細(xì)胞的增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管形成和腫瘤微環(huán)境中起到的重要作用[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)作為血管生成刺激因子，在血管生成的調(diào)節(jié)中起重要作用，是血管系統(tǒng)發(fā)育和分化所必需的，當(dāng)它與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)結(jié)合后，會(huì)使眾多通道上游和下游信號(hào)形成級(jí)聯(lián)，最終增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞周圍組織的增殖、遷移、通透和滲透能力。然而NFAT在肝癌中的作用并沒有明確，并且在肝癌中NFAT與VEGFA的關(guān)系不清楚，為進(jìn)一步探索NFAT蛋白與肝癌發(fā)生發(fā)展及其惡性特征的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)將利用shRNA干擾技術(shù)，觀察干擾NFAT基因?qū)τ谌烁伟〩epG2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞侵襲遷徙及對(duì)VEGFA分子表達(dá)的影響，進(jìn)一步揭示 NFAT 相關(guān)通路與臨床肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2購自北京協(xié)和細(xì)胞中心，DMEM高糖液體培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國(guó)Gibco公司，兔抗人NFAT多克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體購自英國(guó)Abcam公司，羊抗兔IgG—HRP第二抗體購自武漢博士德公司，總RNA提取試劑Trizol、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自大連TaKaRa公司(Cell counting kit-8)CCK-8試劑盒購自日本同仁公司，Transwell小室購自美國(guó)Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1shRNA載體慢病毒的合成 根據(jù)GenBank的人NFAT mRNA(NM_172390)編碼區(qū)序列，遵循設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)干擾病毒，并設(shè)置陰性對(duì)照，shRNA慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建工作由上海吉?jiǎng)P公司完成。序列如下：NFAT-shRNA101：5′-CcggcgGAATCCTGAAACTCAGAAACTCGAGTTTCTGAGTTTCAGGATT-CCGTTTTTg-3′，NFAT-shRNA102：5′-CcggAAGCCGAATTCTCTGGTGGTTCTCGAGAACCACCAGAGA-ATTCGGCTTTTTTTg-3′，NFAT-shRNA103：5′-CcggCTGCATGGCTACTTGGAGAATCTCGAGATTCTCCA-AGTAGCCATGCAGTTTTTg-3′，陰性對(duì)照(CON313)：5′-CcggTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAACGTGA-CACGTTCGGAGAATTTTTg-3′，陰性對(duì)照分子序列與NFAT基因及靶細(xì)胞內(nèi)其他基因無明顯同源性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，青霉素100 U/ml，鏈霉素100 mg/L，37℃、5%CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml，接種至6孔板中，貼壁后遵循慢病毒轉(zhuǎn)染說明書，以MOI=10指數(shù)轉(zhuǎn)染六孔板中細(xì)胞，加人終濃度5 μg/ml的Polybrene，8～12 h根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換新鮮完全培養(yǎng)基，72 h后應(yīng)用熒光觀察及嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)定株篩選，嘌呤霉素篩選13 d后藥物克隆(細(xì)胞群落)出現(xiàn)，用浸有0.25%胰酶的無菌棉簽將群落消化，轉(zhuǎn)移至25 cm培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。細(xì)胞分組：未處理的HepG2細(xì)胞為對(duì)照組，陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞為陰性對(duì)照組，3種干擾慢病毒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞為干擾組。

1.2.3Real-time PCR檢測(cè)NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達(dá) 收集各組細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液洗滌后用Trizol一步抽提法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄盒及實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR反應(yīng)，引物用設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0 設(shè)計(jì)，由蘇州金唯智公司合成。NFAT上游引物：5′-CTCACAGCGATCTATTGTTCC-3′，下游引物：5′-CCTTCAGGTTGTTTCTTTCC-3′，PCR產(chǎn)物265 bp；VEGFA上游引物：5′-GAAAGACAGATCACAGGTACAG-3′，下游引物：5′-TTCCAACAATGTGTCTCTTC-3′，PCR產(chǎn)物241 bp；β-actin上游引物：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′，下游引物：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′，PCR產(chǎn)物500 bp。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)，通過2-ΔΔCt計(jì)算各組相對(duì)對(duì)照組表達(dá)量。

1.2.4Western blot檢測(cè)NFAT蛋白、VEGFA蛋白水平的表達(dá) 提取各組細(xì)胞蛋白并進(jìn)行蛋白定量，將蛋白樣品和5× loading buffer按4∶1的比例混勻，置于沸水中加熱10 min，配制10%SDS-PAGE分離膠，配制濃縮膠，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入NFAT一抗(1∶1 000)、VEGFA一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶5 000)4℃過夜，后以TBST洗脫，1∶3 000二抗封閉作用2 h，TBST洗脫，ECL顯影觀察結(jié)果。

1.2.5CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104ml-1，接種陰性對(duì)照組細(xì)胞(NC組)、對(duì)照組細(xì)胞(control)及干擾組細(xì)胞(shRNA)于96孔板中，每孔各100 μl，每組設(shè)置5個(gè)平行對(duì)照并設(shè)置不含細(xì)胞的空白對(duì)照，培養(yǎng)5 d，每天相同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下OD值。

1.2.6Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲能力 細(xì)胞饑餓24 h后，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104ml-1，以無血清DMEM培養(yǎng)基配制單細(xì)胞懸液，每個(gè)Transwell上室加入200 μl細(xì)胞懸液，下室加入650 μl含10%FBS血清的DMEM培養(yǎng)基，侵襲實(shí)驗(yàn)于小室上層鋪Matrigel基質(zhì)膠，遷徙實(shí)驗(yàn)則不鋪膠。培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦干小室上層，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色30 min，沖洗干凈，在200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率 陰性對(duì)照組及NFAT-shRNA(101-103)慢病毒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞內(nèi)可見綠色熒光。各組慢病毒轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上，后以嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細(xì)胞系，見圖1。

2.2Real-Time PCR檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株中NFAT mRNA、VEGFA mRNA表達(dá) 結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與對(duì)照組之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103干擾組中NFAT mRNA表達(dá)較對(duì)照組及陰性對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明轉(zhuǎn)染攜帶表達(dá)載體的慢病毒后能有效沉默人肝癌HepG2細(xì)胞中NFAT的表達(dá)，其中shRNA103干擾效果最明顯，干擾效率最高，見圖2、3。

圖1 熒光顯微鏡觀察各組HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果Fig.1 Fluorescence microscopy was used to detected HepG2 cells transfected with each groupNote:A.NFAT-shRNA101；B.NFAT-shRNA102;C.NFAT-shRNA103；D.NFAT-NC.

圖2 HepG2各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后NFAT mRNA表達(dá)量Fig.2 HepG2 expression of NFAT mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.3Western blot檢測(cè)各組穩(wěn)定細(xì)胞株中NFAT及VEGFA蛋白表達(dá) 結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組與對(duì)照組蛋白水平表達(dá)無明顯差異，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102、NFAT-shRNA103 干擾組中NFAT蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組及陰性對(duì)照組降低，其中shRNA103組蛋白幾乎不表達(dá)，表明其干擾效果最明顯，干擾效率最高。結(jié)果顯示，NFAT干擾組中VEGFA蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組及陰性對(duì)照組降低，見圖4、5。

圖3 HepG2各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后VEGFA mRNA表達(dá)量Fig.3 HepG2 expression of VEGFA mRNA after transfectedNote:NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖4 Western blot檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞 NFAT蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot analysis were used to detect NFAT expression in HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA101;D.NFAT-shRNA102;E.NFAT-shRNA103.*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control;**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

2.4干擾NFAT基因后對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響 陰性對(duì)照組與對(duì)照組對(duì)于細(xì)胞增殖的影響差異未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，NFAT-shRNA組細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，與陰性對(duì)照組及對(duì)照組相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖，見圖6。

圖5 Western blot檢測(cè)人肝癌HepG2細(xì)胞VEGFA蛋白表達(dá)Fig.5 Western blot analysis were used to detect VEGFA expression in human HepG2 cell linesNote:A.Control;B.Negative control;C.NFAT-shRNA103.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力Fig.6 Determination of cell proliferation by CCK-8Note:*.P<0.05,vs NFAT-NC and Control.

圖7 Transwell檢測(cè)HepG2細(xì)胞侵襲能力Fig.7 Transwell assays of HepG2 cells invasion ability

2.5干擾NFAT基因?qū)epG2細(xì)胞遷徙及侵襲能力的影響 HepG2細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組及陰性對(duì)照組，干擾組遷徙及侵襲數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明干擾NFAT基因后，能有效抑制HepG2細(xì)胞的遷徙及侵襲能力，見圖7～10。

圖8 各組HepG2細(xì)胞穿膜數(shù)Fig.8 Number of invasion of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

圖9 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷徙能力Fig.9 Transwell assays of HepG2 cells migration ability

圖10 各組HepG2細(xì)胞穿膜數(shù)Fig.10 Number of migration of HepG2 cells in each groupNote:NFAT-NC.Negative control group.**.P<0.01,vs NFAT-NC and Control.

3 討論

原發(fā)性肝癌作為全世界最常見的惡性腫瘤，其在惡性腫瘤的死因中位列第二位，僅2015年全球新發(fā)病人數(shù)約745 000人[3]。盡管目前的手術(shù)治療及相關(guān)藥物治療效果較過去有明顯提高，術(shù)后5年生存率可達(dá)50%～60%，但復(fù)發(fā)率也高達(dá)60%～70%，對(duì)于早期診斷、手術(shù)后高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率及不良預(yù)后的問題仍亟待解決。因此，為了改善及提升原發(fā)性肝癌治療的預(yù)后，關(guān)鍵在于對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制中相關(guān)新型特異性及敏感性靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)及研究。本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506作為鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，能抑制NFAT的轉(zhuǎn)錄活化，而且其能顯著抑制HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞增殖，其抑制增殖作用隨劑量增加而增強(qiáng)，這提示 NFAT 可能為促癌基因，NFAT信號(hào)通路的激活與肝癌的發(fā)生有著密切的聯(lián)系，抑制NFAT信號(hào)通路可能會(huì)阻止肝癌的進(jìn)展[4]。同時(shí)NFAT具有多向調(diào)節(jié)功能，其不僅在多種免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞中有表達(dá)，在非免疫細(xì)胞中也存在普遍表達(dá)，并且在胚胎發(fā)育、器官生成中起到重要作用[5,6]。一些研究證實(shí)，在人類實(shí)體惡性腫瘤及血液惡性腫瘤中，NFAT均存在過表達(dá)現(xiàn)象，并且在惡性腫瘤的生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞侵襲遷徙、血管生成及轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)中扮演重要角色[7,8]。

基因沉默技術(shù)常用到的為小干擾RNA(siRNA)，其為一個(gè)長(zhǎng)20～25個(gè)核苷酸的雙股RNA，在生物學(xué)上有許多不同的用途，目前siRNA主要參與RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，以帶有專一性的方式調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)，對(duì)特定基因產(chǎn)生具有專一性的敲弱效果，基因沉默技術(shù)的發(fā)展為腫瘤基因靶向治療提供了新的途徑[9,10]。傳統(tǒng)的干擾基因方式為通過轉(zhuǎn)染siRNA的方法使之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與到RNAi途徑，發(fā)揮使靶基因沉默的效應(yīng)，這一方法受轉(zhuǎn)染效率的影響較大。本實(shí)驗(yàn)采用含shRNA表達(dá)載體的慢病毒干擾目的基因，相對(duì)于siRNA瞬轉(zhuǎn)方式，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，載體可以穩(wěn)定地整合到基因組中，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成shRNA,利用細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶，生成相應(yīng)的siRNA，發(fā)揮RNAi作用，并且在細(xì)胞中脫靶效應(yīng)要低于siRNA，其感染細(xì)胞效率高，干擾效果持久且穩(wěn)定，后期經(jīng)嘌呤霉素篩選出單克隆細(xì)胞株，形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

為保證mRNA被有效抑制，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)不同靶點(diǎn)設(shè)計(jì)3種不同shRNA，在3種干擾病毒作用下，PCR及Western blot結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，NFAT-shRNA101、NFAT-shRNA102及NFAT-shRNA 103組中NFAT mRNA及NFAT蛋白均明顯降低，HepG2細(xì)胞中NFAT基因受到抑制，根據(jù)結(jié)果，確定NFAT-shRNA103組為干擾效果最好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以其作為干擾組。同時(shí)，陰性對(duì)照組未見明顯抑制，表明shRNA抑制具有特異性。各組VEGFA的基因表達(dá)及蛋白表達(dá)結(jié)果表明，NFAT對(duì)于VEGFA的表達(dá)有促進(jìn)作用，其很可能作為NFAT下游的靶蛋白而發(fā)揮作用。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞中激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/NFAT通路后，腫瘤細(xì)胞的侵襲及增殖能力大大增強(qiáng)。Chen等[12]發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用siRNA沉默細(xì)胞內(nèi)VEGFA基因表達(dá)時(shí)，其Transwell結(jié)果顯示侵襲實(shí)驗(yàn)及遷徙實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞穿膜數(shù)均較對(duì)照組明顯減少，且細(xì)胞增殖能力明顯減弱。本實(shí)驗(yàn)中CCK-8及Transwell實(shí)驗(yàn)證明干擾NFAT基因，VEGFA基因及蛋白表達(dá)量明顯減弱，細(xì)胞增殖活性、侵襲及遷徙能力顯著降低，這些結(jié)果表明NFAT可能為其生物學(xué)行為改變的重要基因，激活的NFAT蛋白可能激活下游VEGFA基因，促進(jìn)VEGFA蛋白轉(zhuǎn)錄活化，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞侵襲及增殖能力，而干擾NFAT的表達(dá)后，其生物學(xué)惡性行為明顯減弱。Müller等[13]發(fā)現(xiàn)VEGF由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞分泌，其與內(nèi)皮細(xì)胞上相關(guān)受體(VEGFAR)結(jié)合后，引起PLCγ的激活，從而引起鈣內(nèi)流而使NFAT蛋白轉(zhuǎn)錄活化，而激活的NFAT蛋白又促進(jìn)了VEGFA及VEGFAR的合成從而形成瀑布式效應(yīng)。所以激活NFAT通路后VEGFA及其受體會(huì)持續(xù)轉(zhuǎn)錄活化，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、侵襲及遷徙能力。

綜上所述，NFAT蛋白在肝癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，活化的NFAT蛋白可能通過級(jí)聯(lián)作用激活下游的VEGFA因子，從而增強(qiáng)細(xì)胞的生物學(xué)功能。通過使用靶向NFAT的shRNA載體轉(zhuǎn)染后，不僅抑制NFAT在細(xì)胞內(nèi)的水平，還特異性抑制其生物學(xué)行為，提示NFAT可作為肝癌基因治療的潛在靶點(diǎn)，為臨床肝癌的診斷及治療提供新思路。此外，抑制過表達(dá)NFAT基因?qū)е录?xì)胞增殖、侵襲及遷徙能力改變是否完全依賴于VEGFA的作用，是否存在其他下游靶點(diǎn)的激活或抑制，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。