李亞昭，姚博文，石磊

（西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1.轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心 2.肝膽外科，陜西 西安 710061）

肝細(xì)胞癌（HCC）是目前世界范圍內(nèi)公認(rèn)的第三大惡性腫瘤，且具有極高的致死率，預(yù)后情況極不樂觀[1-3]。目前HCC 的診斷治療方法已經(jīng)逐漸完善，但是對其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究仍是國際研究熱點(diǎn)。通過對侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制的研究，或有望對HCC 的早期診斷及治療產(chǎn)生指導(dǎo)作用。microRNA（miRNA）的發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了新一代了解肝細(xì)胞癌致癌作用的研究方向。miRNA 是一種小的非編碼RNA，能夠通過切割靶信使RNA 或抑制靶基因翻譯的方式來抑制靶基因的表達(dá)[4-6]。許多microRNA（如：miR-149、miR-107、miR-608）[7-9]都已經(jīng)成為HCC 中相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究靶點(diǎn)。

近年來，HCC 相關(guān)的miRNA 研究仍為熱點(diǎn)，機(jī)制研究表明：miRNA 既能夠在腫瘤中發(fā)揮促癌作用（包括促進(jìn)瘤體增殖、侵襲播散及肺轉(zhuǎn)移）又可發(fā)揮抑癌作用（包括促進(jìn)凋亡、抑制細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞遷移）。目前已有研究報(bào)道顯示，miR-671-5p 能夠介導(dǎo)胃癌、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)與手足口病病毒、EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBv）感染及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）介導(dǎo)的肝損傷相關(guān)[10-15]，但其與HCC 之間的具體關(guān)系目前仍未見報(bào)道。因此，本研究的核心在于分析在HCC 發(fā)生時(shí)miR-671-5p 表達(dá)水平的變化，并探究其與HCC 臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性，進(jìn)而探究miR-671-5p 對HCC生物學(xué)行為的影響，并初步探索其下游潛在靶點(diǎn)及分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和器材

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM 購自Gibco 公司；Mir-X? miRNA First-Strand Synthesis Kit 購自TaKaRa 公司；青、鏈霉素購自美國sigma 公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD 公司；胎牛血清購自Gibco公司；miR-671-5p 模擬物和模擬物對照序列、miR-671-5p 抑制物和抑制物對照序列均購自上海GenePhama 公司，miR-671-5p模擬物（5'-AGG AAG CCC UGG AGG GGC UGG AG-3'），miR-671-5p 抑制物（5'-CUC CAG CCC CUC CAG GGC UUC CU-3'）；FastStart Universal SYBR Green Master 購自羅氏公司；miR-671-5p 及U6 引物序列購于吉?jiǎng)P基因；所用抗體E-cadherin（14472S）、N-cadherin（13116S）、vimentin（5741S） 均 購自CST 公司；CFL2（ab96678）購自abcam 公司；β-actin（sc-47778）購自Santa 公司；CCK-8 試劑盒購自日本同仁；CFL2 所用小干擾RNA 購自百奧邁科公司；雙熒光素酶報(bào)告試劑盒購自Promega；lipo2000 購自賽默飛公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)耗材均購自美國Corning 公司。

1.2 標(biāo)本收集

相關(guān)臨床肝臟組織標(biāo)本，均來源于2011年 1月—2013年12月期間在本院行根治性切除術(shù)的HCC 患者，且所有樣品均經(jīng)術(shù)后病理診斷確診為HCC。臨床標(biāo)本共計(jì)80 例（男51 例，女29 例）；年齡分布為35～72 歲，平均年齡為49.8 歲，且在手術(shù)之前均未接受任何非手術(shù)相關(guān)治療。所涉及的每例患者都具有完整病例資料和病理診斷。術(shù)中采集癌組織與癌旁組織（距腫瘤邊緣＞1 cm）后，將組織標(biāo)本迅速液氮冷凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。本研究已取得所有相關(guān)患者知情同意及西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人HCC 細(xì)胞系Hep3B、HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H 以及人正常肝細(xì)胞L02 均在上海復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院肝癌研究所進(jìn)行購買。將添加過雙抗（100 U/mL 青霉素與100 g/mL 鏈霉素）以及10% 胎牛血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液用于細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞培養(yǎng)皿置于恒溫密閉培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。于轉(zhuǎn)染前24 h 胰酶消化并計(jì)數(shù)后接種于6 孔板。每孔細(xì)胞數(shù)為1.5×105個(gè)，使細(xì)胞密度達(dá)到60%。按照Lipofectamine 2000 說明書在6 孔板接種的腫瘤細(xì)胞中，使用miR-671-5p 模擬物/ 抑制物及其對照進(jìn)行轉(zhuǎn)染，且每孔轉(zhuǎn)染量均為30 pmol。通過使用轉(zhuǎn)染小干擾RNA 采用相同方式對CFL2 進(jìn)行低表達(dá)，每孔小干擾RNA 的轉(zhuǎn)染量為10 μL。

1.3.2 RNA 提取及qRT-PCR 檢測 使用TRIzol Reagent 提取組織和細(xì)胞中的總RNA，并按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后應(yīng)用FastStart Universal SYBR Green Master 操作說明進(jìn)行qRT-PCR 檢測。檢測miRNA 表達(dá)時(shí)以U6 作為內(nèi)參，檢測mRNA表達(dá)量時(shí)以β-actin 作為內(nèi)參，利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行基于2-ΔΔct法的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 CCK-8細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn) 對數(shù)期生長細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-671-5p 抑制物及抑制物對照序列后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度至1×104個(gè)/mL 后，向96 孔板內(nèi)每孔加入100 μL（1×103個(gè)/ 孔），每孔設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，5% CO2，37 ℃培養(yǎng)貼壁后，分別于0、24、48、72 h 向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 0.5 h。將酶聯(lián)免疫檢測儀設(shè)置為采集OD450 nm 處的吸光值，使用空白對照調(diào)零后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)孔的吸光值采集，并重復(fù)3 次。

1.3.4 Transwell 小室實(shí)驗(yàn) 將經(jīng)過處理的細(xì)胞消化并重懸，調(diào)整其細(xì)胞懸液濃度為1～2×105個(gè)/mL 后，向每個(gè)小室中加入100 μL 細(xì)胞懸液（其中用于侵襲實(shí)驗(yàn)的小室已提前進(jìn)行Matrigel 膠孵育包被），向小室外的孔中加入500 μL 的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后，將小室在無菌的超凈工作臺中取出，95% 乙醇溶液固定15 min，使用0.1% 結(jié)晶紫染色10 min 后，使用PBS 溶液洗去浮色并自然風(fēng)干。將小室放置于載玻片上并使用倒置顯微鏡拍攝后計(jì)數(shù)（100 倍下隨機(jī)選取6 個(gè)視野，并重復(fù)3 次）。

1.3.5 Western blot 按照RIPA（強(qiáng)）試劑盒說明書提取組織及細(xì)胞內(nèi)的蛋白，經(jīng)BCA 蛋白定量后。用SDS-PAGE 試劑盒配制10% 分離膠后進(jìn)行上樣（每孔總蛋白量為50 μg），使用濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上。50 g/L 脫脂牛奶封閉 4 h，加PBS 稀釋的CFL2 一抗（1:500）、E-cadherin一抗（1:400）、N-cadherin 一抗、vimentin 一抗及β-actin 一抗（1:2000），抗體孵育盒置于4 ℃冰箱孵育14 h；TBST 洗膜4 次且總時(shí)長為30 min，加HRP 標(biāo)記的二抗（抗兔或抗小鼠，稀釋比為 1:10000），室溫孵育3 h；二抗孵育結(jié)束后，繼續(xù)TBST 洗膜4 次且總時(shí)長為30 min 后，使用超敏ECL發(fā)光試劑盒顯影并進(jìn)行灰度掃描后的半定量分析。

1.3.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) PCR 擴(kuò)增絲切蛋白2（CFL2）-3'UTR-WT（野生型）和CFL2-3'UTRMUT（突變型）序列，將擴(kuò)增后的序列分別轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒中；構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別與miR-671-5p 模擬物共同轉(zhuǎn)染Hep3B 細(xì)胞，48 h 后收集細(xì)胞，嚴(yán)格按照說明書操作實(shí)驗(yàn)。最后通過發(fā)光化學(xué)儀檢測螢火蟲及海腎熒光表達(dá)量數(shù)值的比值。

1.3.7 生物信息學(xué)分析 從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://cancergenome.nih.gov）下載HCC 患者的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，分析miR-671-5p 在HCC 組織與癌旁組織的表達(dá)差異，以及miR-671-5p 表達(dá)狀態(tài)與預(yù)測所得靶基因表達(dá)的相關(guān)性。利用TargetScan（www.targetscan.org） 與Starbase（https://www.starbasegame.com）分析miR-671-5p 的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件包分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-671-5p 在HCC 及癌旁組織中的表達(dá)

80 對臨床樣本中，HCC 組織中miR-671-5p的相對表達(dá)量為2.5310±0.0349，癌旁組織為0.3848±0.0248，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖1A）。進(jìn)一步檢測不同腫瘤的TNM 分期的組織中miR-671-5p 的相對表達(dá)量，其中早期（1～2 期） 的病例數(shù)為62 例，中晚期（3～4 期）病例數(shù)為 18 例，兩組的相對miRNA 表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 qRT-PCR 檢測miR-671-5p 表達(dá) Figure1 The expressions miR-671-5p detected by qRT-PCR

經(jīng)生物信息軟件對TCGA 大樣本數(shù)據(jù)庫同步預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中所提供的miR-671-5p 表達(dá)量情況也為HCC 組織的表達(dá)量明顯高于正常組織（P＜0.001）（圖2）。

圖2 TCGA 數(shù)據(jù)庫中miR-671-5p 在HCC 及正常組織中的表達(dá)水平Figure2 The expression levels of miR-671-5p in HCC tissues and tumor adjacent tissues in TCGA database

2.2 miR-671-5p 與HCC 臨床病理因素的關(guān)系

以80 例HCC 的miR-671-5p 平均表達(dá)值（1.995）為標(biāo)準(zhǔn)，將miRNA-671-5p 的含量分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，其中高表達(dá)組42 例，低表達(dá)組38 例。經(jīng)分析結(jié)果顯示，miR-671-5p 的表達(dá)水平與AFP 水平、腫瘤數(shù)目、靜脈侵犯、Edmondson-Steiner 分級及TNM 分期明顯有關(guān)（均P＜0.05），而與性別、年齡、HBV 等指標(biāo)無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

2.3 miR-671-5p 在HCC 細(xì)胞系中的表達(dá)情況

通 過qRT-PCR 檢 測HCC 細(xì) 胞 系Hep3B、MHCC-97H、HepG2、SMMC-7721 和人正常肝細(xì)胞L02 中miR-671-5p 的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與L02 細(xì)胞比較，miR-671-5p 在HCC 細(xì)胞系中的表達(dá)均明顯升高，其中高轉(zhuǎn)移性的MHCC-97H 細(xì)胞系中miR-671-5p 升高最為明顯（均P＜0.05），因此選擇在MHCC-97H 細(xì)胞系中敲低miR-671-5p 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（圖3）。

2.4 轉(zhuǎn)染效率檢測及miR-671-5p 的表達(dá)對HCC細(xì)胞增殖的影響

為了明確miR-671-5p 對細(xì)胞增殖的影響，使用miR-671-5p 抑制物敲低MHCC-97H 內(nèi)的miR-671-5p 的表達(dá)量，通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測其敲低效率，結(jié)果顯示，敲低后miR-671-5p 的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）（圖4）。在不同時(shí)間點(diǎn)，利用CCK-8 法檢測OD450 nm 處經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-671-5p 抑制物或后抑制物對照序列的MHCC-97H 細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果顯示，經(jīng)48 h 轉(zhuǎn)染的miR-671-5p 抑制物的MHCC-97H 細(xì)胞增殖能力與對照組相比明顯下降（P＜0.01）（圖5）。

表1 miR-671-5p 與HCC 臨床病理特征之間的關(guān)系[n（%）]Table1 Relations of miR-671-5p expression with clinicopathologic characteristics of HCC [n (%)]

圖3 miR-671-5p 在HCC 細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)Figure3 The expressions of miR-671-5p in HCC cell lines and normal hepatic cell line

圖4 轉(zhuǎn)染效率檢測Figure4 Determination of the transfection efficiency

圖5 CCK-8 檢測miR-671-5p 對HCC 細(xì)胞增殖的影響Figure5 The influence of miR-671-5p on cell proliferation in HCC cells by CCK-8 assay

2.5 miR-671-5p 的表達(dá)對HCC 細(xì)胞侵襲與遷移的影響

為進(jìn)一步探究miR-671-5p 在HCC 細(xì)胞侵襲與遷移中的具體作用與功能，利用瞬轉(zhuǎn)miR-671-5p 抑制物的方式將MHCC-97H 細(xì)胞中的miR-671-5p 低表達(dá)后進(jìn)行Transwell 實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-671-5p 后MHCC-97H 細(xì)胞系的侵襲與遷移能力均發(fā)生明顯降低（均P＜0.01）（圖6）。

圖6 Transwell 小室檢測miR-671-5p 對HCC 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（×100）Figure6 Transwell assay to assess the effect of miR-671-5p on migration and invasion in HCC cells (×100)

2.6 miR-671-5p 靶基因分析及其表達(dá)情況

經(jīng)TargetScan 及Starbase 分析發(fā)現(xiàn)，CFL2與miR-671-5p 存在堿基互補(bǔ)配對，CFL2 為miR-671-5p 的潛在靶基因（圖7A）。目前已有報(bào)道稱，CFL2 在多種腫瘤內(nèi)中表達(dá)降低，并存在抑制上皮細(xì)胞- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）發(fā)生的功能。從而抑制HCC 的侵襲及遷移，為明確miR-671-5p 與CFL2 的關(guān)系，通過使用miR-671-5p 抑制物下調(diào)MHCC-97H細(xì)胞系中miR-671-5p 的表達(dá)后，經(jīng)qRT-PCR 檢測CFL2 表達(dá)量，結(jié)果顯示CFL2 的表達(dá)量明顯升高（P＜0.001）（圖7B），并且在MHCC-97H 細(xì)胞系中CFL2 的表達(dá)量與miR-671-5p 的表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（圖7C）。經(jīng)TCGA 數(shù)據(jù)庫分析，證實(shí)CFL2 在HCC 中表達(dá)量明顯降低（P＜0.01），且與miR-671-5p 的表達(dá)量呈明顯負(fù)相關(guān)（P＜0.01）（圖7D-E）。

圖7 靶基因分析及驗(yàn)證 Figure7 Analysis and verification of the target gene

2.7 miR-671-5p 表達(dá)水平對CFL2 的表達(dá)的影響極其與EMT 的關(guān)系

為進(jìn)一步明確miR-671-5p 對CFL2 的調(diào)控作用，通過突變miR-671-5p 與CFL2 的結(jié)合位點(diǎn)后，進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測。結(jié)果顯示當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)被突變后，高表達(dá)miR-671-5p 無法再引起CFL2 的mRNA 水平的變化，從而證實(shí)了miR-671-5p 與CFL2 之間的相互結(jié)合（圖8A-B）。通過qRT-PCR 驗(yàn)證CFL2 siRNA 的敲除效率，發(fā)現(xiàn)CFL2 siRNA1 敲除效果最好（圖8C），因此使用siRNA1 對CFL2 的表達(dá)進(jìn)行敲低。經(jīng)Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)miR-671-5p 后CFL2 蛋白表達(dá)水平明顯升高，同時(shí)抑制了EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)。當(dāng)在低表達(dá)miR-671-5p 的基礎(chǔ)上同時(shí)敲低CFL2，檢測發(fā)現(xiàn)CFL2 的表達(dá)量降低且部分抵消了miR-671-5p 對EMT 相關(guān)指標(biāo)蛋白表達(dá)的抑制作用（圖8D-E）。因此，在細(xì)胞水平間接證明了CFL2 為miR-671-5p 的潛在靶點(diǎn)，而miR-671-5p 可通過抑制CFL2 的表達(dá)促進(jìn)HCC 細(xì)胞EMT 的發(fā)生。

圖8 miR-671-5p 對CFL2 的調(diào)控及其對EMT 的影響 Figure8 Regulation of miR-671-5p on CFL2 and their influence on EMT

3 討 論

目前HCC 的診斷治療方法已經(jīng)逐漸完善，HCC 分子機(jī)制研究中涉及miRNA、lncRNA、外泌體、循環(huán)RNA 等諸多分子，已成為近年研究的熱 點(diǎn)領(lǐng)域[16-23]，例如miR-149、miR-122、miR-107、miR-608、miR-221[7-9,24-26]發(fā)現(xiàn)在HCC 的致癌作用中發(fā)揮的作用調(diào)節(jié)目標(biāo)基因。目前現(xiàn)有研究結(jié)果顯示miR-671-5p 與膠質(zhì)瘤、胃癌、黑色素瘤等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有緊密的聯(lián)系，同時(shí)與手足口病、EB 病毒感染及HBV 介導(dǎo)的肝損傷相關(guān)[10-15,19]，但其與HCC 的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系目前仍未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR 檢測了來源于本院的共計(jì)80 對HCC 患者組織樣品及與之對應(yīng)的癌旁組織中miR-671-5p 的表達(dá)；應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miR-671-5p 的表達(dá)水平與HCC 臨床病理特征的相關(guān)性；通過qRT-PCR 法檢測HCC 細(xì)胞系中miR-671-5p 的表達(dá)水平，并應(yīng)用Transwell 分析miR-671-5p 對HCC 相關(guān)細(xì)胞系的侵襲與遷移能力的影響。發(fā)現(xiàn)miR-671-5p 在HCC 組織中表達(dá)顯著升高，并通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫資源篩選分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的miR-671-5p 與腫瘤數(shù)目、Edmondson-Steiner 分級、靜脈侵犯、AFP 水平、病理分級及TNM 分期顯著相關(guān)。綜上所述，miR-671-5p 應(yīng)為HCC 中的促癌基因。

為探討miR-671-5p 在HCC 中的具體作用及其分子機(jī)制，本研究檢測了HCC 細(xì)胞系（MHCC-97H、Hep3B、HepG2、SMMC-7721）及正常肝細(xì)胞L02 中miR-671-5p 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，HCC 相關(guān)的各種細(xì)胞系中miR-671-5p 表達(dá)都呈現(xiàn)升高的狀態(tài)，與之前結(jié)果相符。

HCC 發(fā)生發(fā)展過程中，最為重要和常見的生物學(xué)行為就是侵襲與轉(zhuǎn)移，其中EMT 的發(fā)生則是侵襲中最為重要的環(huán)節(jié)[27-28]。關(guān)于miR-671-5p 的多項(xiàng)研究已經(jīng)表明，miR-671-5p 與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有顯著的相關(guān)。本研究中，使用miR-671-5p inhibitor 下調(diào)了HCC 細(xì)胞系中miR-671-5p 的表達(dá)水平，通過Transwell 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究miR-671-5p 與HCC 侵襲與遷移能力之間的關(guān)系，所得到的結(jié)果為低表達(dá)miR-671-5p 能夠顯著抑制HCC 相關(guān)細(xì)胞系的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前也有報(bào)道稱miR-671-5p 能夠通過抑制URGCP 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑癌作用[12]。同時(shí)，miR-671-5p 也可以抑制乳腺癌細(xì)胞EMT 的發(fā)生[13]，但其具體分子機(jī)制均不明晰。因此，后續(xù)的分子機(jī)制研究，則需要進(jìn)一步驗(yàn)證其可能潛在的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而確定可能的未來的治療靶點(diǎn)。

CFL2 是目前腫瘤相關(guān)的熱點(diǎn)靶基因，是一種細(xì)胞骨架蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)胞骨架重塑。與多種惡性腫瘤相關(guān)，通過抑制CFL2 從而抑制腫瘤的侵襲遷移及EMT 的發(fā)生[27,29-32]。經(jīng)TargetScan 及Starbase 分析發(fā)現(xiàn)，CFL2 為miR-671-5p 的可能靶基因。經(jīng)過Western blot 發(fā)現(xiàn)低表達(dá)miR-671-5p 后，CFL2 蛋白顯著高表達(dá)，EMT 的指標(biāo)下調(diào)。同時(shí)回復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EMT 指標(biāo)能夠被顯著逆轉(zhuǎn)。因此能夠間接證明CFL2 可能為miR-671-5p的潛在靶點(diǎn)。

綜上，miR-671-5p 在HCC 組織標(biāo)本及HCC細(xì)胞系中高表達(dá)，與其惡性程度顯著相關(guān)。miR-671-5p 能夠促進(jìn)HCC 細(xì)胞系的增殖、侵襲及遷移，并通過抑制CFL2 的表達(dá)來促進(jìn)EMT 的發(fā)生。此項(xiàng)研究或許能夠?yàn)镠CC 后續(xù)的精準(zhǔn)診療工作提供潛在靶點(diǎn)與相關(guān)理論依據(jù)。