楊佳興,徐紅偉,王迎,王亮,王建國(guó),李世朋
(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 肝膽外科,河南 新鄉(xiāng) 453100)
肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)惡性程度高,其發(fā)病率在所有腫瘤中高居第4位,致死率較高[1-3],中國(guó)每年HCC死亡例數(shù)占約占全球總數(shù)的55%,現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民群眾健康的重大惡性腫瘤之一[4-5]。目前臨床醫(yī)生對(duì)于HCC的診斷工具主要依靠彩超、CT、MR及AFP等檢查、檢驗(yàn),但HCC起病隱匿,癥狀不明顯,待發(fā)現(xiàn)時(shí)大多已屬于中晚期,手術(shù)切除、射頻消融、介入等治療方法有效的提高了HCC患者生存率[6],但總體預(yù)后難以令人滿意,5年生存率約30%~40%[7]。因此,尋找新的HCC診斷分子標(biāo)志物意義仍然重大。
目前,高通量測(cè)序技術(shù)能夠從整個(gè)基因組或轉(zhuǎn)錄組水平探索疾病的發(fā)生、發(fā)展,已廣泛用于一些疾病基因表達(dá)譜分析、基因克隆和尋找特異性分子標(biāo)志物[8-9]。白文萱等[10]通過(guò)生物學(xué)信息分析的方法,對(duì)HCC基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘,發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)在HCC中表達(dá)上調(diào),可作為HCC特異性的免疫治療靶點(diǎn);Zhang等[11]通過(guò)高通量測(cè)序生物學(xué)分析的方法發(fā)現(xiàn)HCC差異表達(dá)的基因在抗原處理與呈遞、補(bǔ)體級(jí)聯(lián)和 I型干擾素信號(hào)通路有協(xié)同或拮抗作用,而這些對(duì)HCC的發(fā)生與侵襲能力變化有重要影響,高通量測(cè)序技術(shù)是測(cè)序技術(shù)發(fā)展的里程碑,它為現(xiàn)代生命技術(shù)研究提供了前所未有的機(jī)遇[12]。
外泌體是細(xì)胞分泌的功能性小體,直徑為30~150 nm,在人體血液、唾液、尿液等體液中均能夠被檢測(cè)到[13]。其體積微小并且自身穩(wěn)定,脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)可有效保護(hù)miRNA、mRNA和其它非編碼RNA核酸分子不被降解[14-15],被認(rèn)為是腫瘤標(biāo)志物的天然載體,近年在腫瘤診斷、發(fā)生發(fā)展機(jī)制、靶向治療中越來(lái)越得到重視。Wang等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-122、miR-1246和miR-148a在HCC患者中呈顯著性高表達(dá),其中miR-148a診斷效能顯著優(yōu)于AFP(0.891 vs.0.712),此外miR-122、AFP和miR-148a聯(lián)合用于區(qū)分HCC和肝硬化患者的診斷效能高達(dá)0.931。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HCC患者血清外泌體中的miR-9-3P水平明顯降低,成纖維細(xì)胞因子5(HBGF-5)在細(xì)胞增殖中具有重要作用,后者是miR-9-3P潛在的靶mRNA,miR-9-3P過(guò)表達(dá)顯著下調(diào)了HBGF-5在mRNA和蛋白水平的表達(dá),進(jìn)而影響了HCC細(xì)胞的增殖[17]。
綜上,筆者推測(cè)HCC患者與正常人之間血清外泌體mRNA存在較大差異,可能篩選出有意義的分子標(biāo)志物,故擬通過(guò)高通量測(cè)序方法進(jìn)行檢測(cè),以期尋找合適的HCC診斷標(biāo)志物。
收集2018年8月—2018年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院就診的HCC患者血液標(biāo)本3例(Ca1、Ca2、Ca3),均有乙型肝炎及肝硬化病史,且腫瘤病理類型均經(jīng)病理科醫(yī)師確診 (其中Ca1為中分化HCC,部分侵及肝被膜,可見脈管內(nèi)癌栓;Ca2為低分化HCC,緊鄰被膜;Ca3為中分化HCC)。3例HCC患者中男2例、女1例。同時(shí)收集3例正常志愿者血液標(biāo)本(N1、N2、N3)作對(duì)照,3例正常志愿者中男2例、女1例。采集樣本前均未接受臨床治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。
儀器:illumina Hiseq Xten;模式:PE150;試劑:Agencourt Ampure XP beads,美國(guó)Beckman Coulter公司;NEBNext? Ultra? RNA Library Prep Kit for Illumina,美國(guó)NEB公司;HiSeq Rapid SBS Kit V2(200 cycle),美國(guó)Illumina公司;HiSeq Rapid PE Cluster Kit V2,美國(guó)Illumina公司。
所有研究對(duì)象采集靜脈血6 mL,EDTA-K2抗凝管收集靜置,然后離心取血清。血清外泌體采用銳博外泌體提取試劑盒RiboTMExosome Isolation Reagent(for plasma or serum)提取,嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明進(jìn)行操作。外泌體表面蛋白標(biāo)志物采用Western blot進(jìn)行檢測(cè),所用抗體包括CD9、CD63、TSGl01及羊抗兔二抗。
用Magen試劑盒提取外泌體RNA,操作步驟詳見說(shuō)明書。
首先對(duì)HCC患者血清外泌體mRNA進(jìn)行純化等前期處理,然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄形成cDNA、PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)操作,再經(jīng)過(guò)文庫(kù)質(zhì)檢后上機(jī)測(cè)序;再對(duì)測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),以取得高質(zhì)量的數(shù)據(jù),并對(duì)高質(zhì)量的數(shù)據(jù)及參考數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì),獲得BAM文件。上機(jī)測(cè)序由廣州市銳博生物公司測(cè)序,并進(jìn)行差異表達(dá)外泌體mRNA進(jìn)行分析,采用AUdics對(duì)差異表達(dá)mRNA進(jìn)行分析。對(duì)差異表達(dá)的外泌體mRNA進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG pathway分析。
篩選的差異表達(dá)外泌體mRNA統(tǒng)計(jì)結(jié)果如 圖1,其中HCC組相對(duì)正常人組上調(diào)397個(gè)外泌體mRNA,192個(gè)外泌體mRNA表達(dá)下調(diào)。
圖1 mRNA 差異表達(dá)火山圖Figure1 Volcanic map of the mRNAs with differential expression
對(duì)差異外泌體mRNA進(jìn)行表達(dá)差異性分析,采用HCC組相對(duì)正常人組外泌體mRNA表達(dá)fold change(log2,表達(dá)差異倍數(shù))對(duì)差異蛋白進(jìn)行篩選,挑選條件如下:Log2≤1.9或者Log2≥2.5;表達(dá)水平顯著增加的外泌體mRNA17個(gè),表達(dá)水平明顯降低的外泌體mRNA14個(gè)(表1)。
表1 兩組表達(dá)差異顯著的外泌體mRNA Table1 The exosomal mRNAs with significantly different expressions between the two group
根據(jù)差異外泌體mRNA檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行層次聚類分析,分析結(jié)果如圖2,其中X 軸代表進(jìn)行聚類分析的差異比較組,Y軸代表樣本差異外泌體mRNA。顏色代表差異倍數(shù),越綠表示下調(diào)倍數(shù)越大,越紅則表示上調(diào)倍數(shù)越大。
分別對(duì)表達(dá)下調(diào)與表達(dá)上調(diào)的外泌體mRNA的靶基因做GO顯著性富集分析,如圖3-4,其中橫坐標(biāo)為差異外泌體mRNA的靶基因數(shù),縱坐標(biāo)表示GO terms。GO terms總共有3類,分別以不同顏色標(biāo)注(橙色:分子功能,紅色:細(xì)胞成分,綠色:生物過(guò)程)。結(jié)果顯示表達(dá)下調(diào)的外泌體mRNA的靶基因與嗅覺受體活性、細(xì)胞因子活性、CXCR趨化因子受體結(jié)合、中間絲、中間絲狀細(xì)胞骨架等有關(guān);表達(dá)上調(diào)的外泌體mRNA的靶基因與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)異二聚化活性、免疫系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)節(jié)、胞外囊泡、細(xì)胞外細(xì)胞器、應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)。
圖2 差異表達(dá)外泌體mRNA 層次聚類分析Figure2 Hierarchical clustering analysis of differentially expressed exosomal mRNAs
圖3 表達(dá)下調(diào)mRNA 的GO 分析 Figure3 GO analysis of the down-regulated mRNAs
圖4 表達(dá)上調(diào)mRNA 的GO 分析Figure4 GO analysis of the up-regulated mRNAs
分別對(duì)表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的血清外泌體mRNA進(jìn)行KEGG富集分析,結(jié)果詳見圖5與圖6所示,橫坐標(biāo)表示差異外泌體mRNA的靶基因數(shù)量,縱坐標(biāo)表示二級(jí)KEGG通路,圖中用不同顏色表示一級(jí)通路類別。KEGG通路分析顯示,在下調(diào)的外泌體mRNA中9條通路被顯著富集(圖5),并且在上調(diào)的外泌體mRNA中,30條通路被顯著富集(圖6)。 其中,在下調(diào)的外泌體mRNA中,“基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子”和“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”分別是最豐富和最有意義的通路。在上調(diào)的外泌體mRNA中,“血小板激活”、“Rap 1信號(hào)通路”、“吞噬體”、“病毒致癌”、“肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)”與“抗原處理和呈遞”等是最豐富和最有意義的通路。
圖5 表達(dá)下調(diào)mRNA 的KEGG 通路Figure5 KEGG pathway analysis of the down-regulated mRNAs
圖6 表達(dá)上調(diào)mRNA 的KEGG 通路Figure6 KEGG pathway analysis of the up-regulated mRNAs
外泌體作為理想的腫瘤標(biāo)志物的載體,廣泛分布于人體各種體液中。大量研究[18-22]已經(jīng)證實(shí)其攜帶的蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA與lncRNA還有rRNA、tRNA、vtRNA、Y-RNA、circRNA等在細(xì)胞間進(jìn)行信息交換和調(diào)節(jié)受體細(xì)胞活動(dòng),而腫瘤來(lái)源的外泌體可以調(diào)節(jié)宿主微環(huán)境,增強(qiáng)侵襲能力,最終導(dǎo)致疾病進(jìn)展。有研究[23]顯示,來(lái)自HCC細(xì)胞的外泌體miRNA可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β活化激酶-1的表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)受體細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲。有學(xué)者[24]發(fā)現(xiàn),HCC患者血清外泌體miR-665水平明顯高于健康受試者,其升高水平與腫瘤大小、局部浸潤(rùn)、臨床分期及生存時(shí)間密切相關(guān),推測(cè)血清外泌體miR-665可以用于HCC診斷和判斷預(yù)后。另有研究[25]結(jié)果顯示,HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222、miR-224水平顯著高于慢性乙型肝炎(CHB)和肝硬化患者。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)大鼠血清外泌體中的miRNA-10b在肝硬化即表達(dá)增加,在HCC階段明顯增加可達(dá)正常水平的10倍以上。Hoshion等[27]發(fā)現(xiàn)腫瘤的器官親嗜性轉(zhuǎn)移與外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)整聯(lián)蛋白激活受體細(xì)胞的Src基因和S100基因表達(dá)密切相關(guān)。腫瘤生長(zhǎng)依賴于血液供應(yīng)的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),大量研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與的內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管再生對(duì)HCC的發(fā)展轉(zhuǎn)移至關(guān)重要,Huang等[28]發(fā)現(xiàn)HCC細(xì)胞可分泌Ⅰ型跨膜蛋白VASN(vasorin)至外泌體,通過(guò)硫酸肝素蛋白聚糖(HSOGs)介導(dǎo)的胞吞作用轉(zhuǎn)運(yùn)至人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中促進(jìn)其遷移。綜上,HCC血清外泌體攜帶的核酸類物質(zhì)是肝癌發(fā)生、發(fā)展中的重要因素,近年來(lái)對(duì)HCC外泌體miRNA研究較多[29],而mRNA研究較少,本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)HCC患者血清外泌體mRNA進(jìn)行檢測(cè),進(jìn)一步證實(shí)了外泌體內(nèi)攜帶的腫瘤來(lái)源物質(zhì)可用于HCC的早期診斷、耐藥性檢測(cè)、預(yù)后評(píng)估及治療[30]。
He等[31]發(fā)現(xiàn)外泌體mRNA直接參與HCC的轉(zhuǎn)移活動(dòng),并且還發(fā)現(xiàn)由外泌體激活了PI3K/ART通路,從而導(dǎo)致了腫瘤進(jìn)展。Akiba等[32]曾發(fā)現(xiàn)HCC組織mRNA、蛋白質(zhì)水平中的CXCL8基因表達(dá)均升高,其可增強(qiáng)HCC細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,使腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)移。CXCL8促進(jìn)腫瘤血管生成的作用可能與其氨基端的ELR(Glu-Leu-Arg,谷氨酸-亮氨酸-精氨酸)序列有關(guān)[33]。BEX蛋白(brain expressed X-linked protein)的基因?qū)儆赬染色體連鎖基因家族[34],Braeuning等[35]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中BEX1的mRNA水平比正常組織中高 400 倍,其推測(cè)BEX1 是HCC 的可靠的腫瘤標(biāo)志物。趨化因子PF4(又稱為血小板因子4)屬于ELRCXC 趨化因子亞家族,其編碼基因位于4 號(hào)染色體長(zhǎng)臂,有研究表明趨化因子PF4 能夠通過(guò)干擾血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子及其受體的相互作用,抑制血管新生[36]。另有研究[37]表明PF4 與其受體相互作用后,可通過(guò)c AMP/PKA通路抑制m-鈣蛋白酶的活化,從而阻止細(xì)胞遷移。此外RGS18基因與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)通路有關(guān),而GPCR 通路異常與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[38]。GPCR家族趨化因子受體在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移中具有重要作用,其異常高表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力,趨化因子在腫瘤微環(huán)境中局部釋放后能通過(guò)自分泌和旁分泌途徑增強(qiáng)癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和存活能 力[39],筆者推測(cè)這兩種基因在HCC中同樣具有重要作用。
根據(jù)上述CXCL8 及BEX、RGS18 等基因在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用來(lái)看,本實(shí)驗(yàn)所篩選出來(lái)的關(guān)鍵基因在一定程度上是可靠的,有進(jìn)一步研究的價(jià)值。我們有理由相信有可靠的外泌體mRNA會(huì)成為HCC 診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”,甚至未來(lái)在靶向基因治療方面有立足之地。但本研究樣本量較小,下一步擬對(duì)差異顯著的mRNA在擴(kuò)大樣本量的血清及HCC組織中進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。