尤明亮

天津市西青區(qū)疾病預防控制中心 300393

無論是引起感染甚至傳染病的微生物，還是食源性病原微生物，都會給人類健康造成不同程度的威脅，且兩種病原微生物之間存在一定的共性，突出表現(xiàn)為種類繁多，變異速度異常迅猛，現(xiàn)有的病原微生物主要包括細菌、病毒等幾種類型。針對病原微生物進行科學合理的檢測與判斷，可起到預防并控制疾病的作用，也給后續(xù)用藥奠定了基礎。傳統(tǒng)的微生物檢測和判斷以病原微生物分離為主，還存在過度依賴病原微生物生理生化特征和形態(tài)學觀察等問題。這種方法雖然起到了一定的作用，但是存在明顯的局限性。加之不斷發(fā)現(xiàn)的病原微生物的影響，病原微生物檢測工作的難度與日俱增，如何更好地完成病原微生物檢測，已經(jīng)成為各級研究人員重點研究的問題。

1 以雜交為核心發(fā)展起來的分子診斷技術

1.1 基因芯片技術的應用進展 基于核酸分子雜交發(fā)展而來的基因芯片也可稱之為DNA芯片，基因芯片技術主要是借助特殊的功法，將核酸探針分子排列至處理過的玻璃片或者硝酸纖維素膜表面，最為常用的方法為光導原位合成，還可適當使用微量點樣法。值得注意的是，用于承載核酸探針分子的支持物統(tǒng)一為2cm2。排列工作完成后需要進行雜交，雜交對象以標記樣品分子為主，從而利用先進的計算機軟件和信息技術判斷樣品信號，將信號的強弱作為著手點，明確樣品中是否存在病原微生物，如果發(fā)現(xiàn)病原微生物的存在，還要了解其數(shù)量信息[1]。相對于以往的檢測技術而言，基因芯片技術的特異性更強，且擁有高通量化的優(yōu)勢。但是受到成本的影響，基因芯片技術還未大面積的推廣與使用。另外，基因芯片技術的專業(yè)性較強，涉及多個學科，推廣難度較高[2]。在醫(yī)學技術和檢測水平不斷提高的同時，人們發(fā)現(xiàn)了越來越多的特異性記憶，這給基因芯片技術的發(fā)展注入了全新的活力。長此以往，基因芯片技術一定會在基層大面積推廣并使用，檢測結果更是會得到跨越式的提升。

1.2 DNA傳感器技術的應用進展 DNA是DNA傳感器技術的重要組成部分，扮演著極為重要的角色，起著敏感元件的作用，而核酸雜交則是DNA傳感器技術發(fā)展的基礎與核心。利用DNA傳感器技術進行病原微生物檢測時，需要在傳感器上固定一條單鏈DNA，此時的DNA序列為已知狀態(tài)，然后通過與互補單鏈DNA雜交的方式對病原微生物中的信號進行檢測[3]。檢測工作主要是圍繞可檢測信號進行，而現(xiàn)階段的可檢測信號分為光或電幾種。因此應利用相應的技術或信號轉化器，將原本不可檢測的濃度轉變?yōu)榭蓹z測信號[4]。如今，DNA傳感器主要由兩大部件組成。分別是識別元件還有信號轉換器，而敏感元件還可細分至兩個類別，分別為免疫傳感器，還有DNA傳感器。DNA傳感器并不是像我們想象中的那樣強大，雖然說其速度較快，準確性較高，但是靈敏度卻遠不及其他類型的傳感器，且存在特異性較差的問題。有學者將三種技術聯(lián)合起來創(chuàng)造了創(chuàng)新型的DNA傳感器檢測系統(tǒng)，這個基于DNA生物傳感技術，還有真菌核糖體分型技術建立起來的真菌檢測DNA傳感器檢測系統(tǒng)，有效地縮短了檢測時間，傳統(tǒng)的檢測方法需要3d左右才能全部完成診斷工作，而該系統(tǒng)將診斷時間縮短至6h，為病原微生物的分型研究提供了全新的思路[5]。

2 以擴增為核心發(fā)展起來的分子診斷技術

2.1 隨機擴增多態(tài)性DNA技術的應用進展 作為一種核苷酸引物，可在基因組DNA區(qū)域中起到擴增PCR的作用，這是RAPD最為顯著的作用，但是對溫度提出了較高的要求，必須處于低復性溫度之下，且基因組DNA區(qū)域必須擁有較高的同源性[6]。因為，菌株之間存在一定的差異性，所以任意引物雜交的位置也會因為菌株之間的差異而發(fā)生變化，數(shù)目也不相同。從理論上講，模板任意引物雜交可形成特定的圖譜。要想在檢測過程中了解菌株基因組DNA的特點，必須善于利用脈沖場凝膠電泳，這是利用多態(tài)性檢測反映出不同菌株特點的重要舉措[7]。從某種角度來說，基于脈沖場凝膠電泳進行的多態(tài)性檢測是一種用于DNA分型的重要手段，在菌株分子分型鑒定中起著極為重要的作用，也是分子診斷技術的發(fā)展趨勢。經(jīng)諸多實踐證明，隨機擴增多態(tài)性DNA技術擁有簡便且快速的特性，但是其重復性有待提升，并對聚合酶類型提出了較為苛刻的要求，只有在規(guī)定量的DNA濃度或質量中才可使用[8]。

2.2 數(shù)字PCR技術的應用進展 數(shù)字PCR技術的研究與應用，逐步實現(xiàn)了絕對定量樣品的目標。該技術主要是通過微球乳糜液化的作用，將乳糜液成功的分散至芯片微孔當中，每個芯片微孔當中至少有一個核酸模板的存在[9]。然后利用恰當?shù)脑噭┖腿玖蠈π酒⒖揍尫诺臒晒庑盘栠M行檢測。這樣做的目的是判斷反應體系中是否有靶核酸模板的存在，有把核酸模板的芯片微孔會在檢測過程中釋放出相應的熒光信號，通過對兩種信號的數(shù)目和比例進行統(tǒng)計后，即可明確絕對定量[10]。從本質上來說，數(shù)字PCR與定量PCR之間存在極大的不同，最為突出的就是數(shù)字PCR擺脫了定量PCR必須應用標準曲線的難題，且不會對模板Ct值產(chǎn)生過多地依賴，并在絕對定量當中起到了極為重要的作用。靈敏度較高，準確度良好。當前，微滴式數(shù)字PCR已經(jīng)得到了大面積的應用，并以商品化的形式應用于多項臨床領域，例如牛丘疹病毒、口腔病毒還有巨細胞病毒的檢測當中[11]。

2.3 核酸適配體技術的應用進展 經(jīng)過不斷的實踐和發(fā)展，核酸適配體技術的應用范圍越來越廣，現(xiàn)已成功應用于臨床診斷當中，臨床治療也有核酸適配體技術的身影。所謂核酸適配體技術，就是利用必要的手段尋找寡核苷酸片段，這種片段可以是蛋白或者酶，也可以是小分子物質，其具備親和力較高的特征，需要在隨機寡核苷酸序列庫中進行反復的篩選，篩選時多使用配體系統(tǒng)凈化技術[12]。該技術主要由擴增、調節(jié)、分離等5個步驟組成，還有結合和洗脫。雖然，每個步驟都相當重要，但是最為核心的就是分離，這也是適配體靶分子篩選的關鍵環(huán)節(jié)。適配體的特征相當明顯，擁有較高的特異性，親和力較強，靶標范圍極為廣泛，修飾較為簡單。可大面積應用于某種特定蛋白的適配體當中，核酸的適配體也可對其進行使用。不久的將來，適配體系統(tǒng)進化技術極有可能完全取代抗體，但是現(xiàn)有的技術仍舊無法達成抗體取得的成就，在適配體種類方面仍有一定的局限。但是已經(jīng)有學者對核酸適配體技術的應用提出了全新的思路，無論是特異性傳遞系統(tǒng)，還是基因治療，都為核酸適配體技術的應用與發(fā)展指明了確切的方向[13]。

3 以序列為核心發(fā)展起來的分子診斷技術

高通量測序主要由3個部分構成，分別為第二代邊合成邊測序、第三代單分子測序和第四代納米孔測序技術[14]。高通量測序的特征十分鮮明，優(yōu)勢也較為明顯，可應用于大樣品當中。但是其專業(yè)性較強，對操作人員的技術水平和實踐經(jīng)驗均提出了較高的要求。無論是在結核病的早期分型和計算分析當中，還是對耐藥基因進行的研究，都可利用高通量測序?？梢?，高通量測序在病原微生物檢測中做出了突出的貢獻。在不斷研究與深化的過程中，基于雜交而發(fā)展起的擴張分組技術極有可能被高通量測序所取代，用于預防流行性疾病的爆發(fā)與惡化。

如今，第二代測序技術已經(jīng)取得了極為顯著的成就，并在不斷運行過程中形成了完善且成熟的測序技術。但成本昂貴的問題并沒有得到改善，甚至會在測序過程中出現(xiàn)低級錯誤，這也是制約第二代測序技術推廣的直接因素。在第二代測序的基礎之上，第三代測序技術完成了測序時間和成本的改善，且將單分子測序的目標落實到了整個檢測工作當中。但是過于昂貴的儀器成本和數(shù)據(jù)分析等因素，仍舊制約了第三代測序技術的推廣與使用[15]。納米孔測序技術就是指第四代基因測序技術，該項技術可以說是以下兩種技術的結合，也就是單分子檢測技術，還有電子信號檢測技術。雖然說納米孔檢測技術擁有極強的優(yōu)勢，并進行了多次實踐與使用，但是還未形成成熟的運行體系，并未進入商用階段。

4 討論

雖然，分子診斷技術在診斷效率和結果準確性方面占據(jù)無法比擬的優(yōu)勢，但是其應用范圍仍舊不如傳統(tǒng)的檢測方法。就目前來看，大多數(shù)食源性病原微生物檢測和醫(yī)學性病原微生物檢測仍然依靠傳統(tǒng)的檢測方法，這不僅是因為傳統(tǒng)的病原微生物檢測相對可靠，還因為新興的分子診斷技術存在試劑成本高、儀器價格昂貴等多種局限。如今，只有國家級科研機構或者海關開始應用分子診斷技術，大多數(shù)基層單位還是使用傳統(tǒng)方法進行檢測。值得注意的是，現(xiàn)階段仍然沒有一種單一的分子診斷技術，可滿足高靈敏度和自動化等多項要求?？梢?，不僅要克服分子診斷技術在推廣與應用中的不足，還要利用多學科聯(lián)用的方式提高分子診斷技術的自動化水平。這有助于病原微生物檢測取得更為理想的成果，并朝向自動化的方向發(fā)展。在多個部門和各級研究人員的努力之下，新型分子診斷技術一定會實現(xiàn)高通量、多組學聯(lián)合判斷的目標，更好地作用于病原微生物檢測中。