符偉玉，林小聰，陳小誼，余華軍，蘭柳波

長鏈非編碼 RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 是一類不編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)源性RNA 轉(zhuǎn)錄本，長度大于200個核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和衰老等重要的生物學(xué)過程[1]。研究[2]表明，lncRNA在胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及預(yù)后中均具有重要作用，可能成為胃癌診斷標(biāo)志物及治療靶點。

通過高通量的lncRNA芯片檢測，本研究已經(jīng)從胃癌組織樣本中篩選出多個差異表達的lncRNA分子；lncRNA BC002811在芯片結(jié)果中呈明顯的表達上調(diào)[3]。本研究通過構(gòu)建BC002811重組慢病毒載體，篩選出BC002811穩(wěn)定表達的胃癌HGC-27細(xì)胞系，并觀察BC002811對HGC-27細(xì)胞增殖的影響，為進一步探討B(tài)C002811在胃癌中的作用及其分子機制提供有力的支持。

1 材料與方法

1.1 材料BC002811全長基因序列由蘇州金唯智生物科技公司合成；pLVX-EGFP-IRES-neo載體，pHelper 1.0及2.0輔助包裝質(zhì)粒購自廣州萊德聯(lián)康生物公司；人胚腎HEK293T細(xì)胞和胃癌HGC-27細(xì)胞由本實驗室保存；DH5α感受態(tài)細(xì)胞為北京鼎國昌盛生物公司產(chǎn)品；RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基以及胎牛血清均由美國Hyclone公司生產(chǎn)； LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑和qPCR試劑盒購自美國Invitrogen公司；XhoⅠ和NotⅠ限制性核酸內(nèi)切酶為上海碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶由日本TaKaRa公司生產(chǎn)；高純度質(zhì)粒小量提取試劑盒及DNA凝膠回收試劑盒為廣州東盛生物公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和MTS試劑購自美國Promega公司。

1.2 方法

1.2.1BC002811全基因序列的PCR擴增 根據(jù)BC002811全基因序列設(shè)計含有XhoⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點的引物，并進行PCR擴增。正向引物序列：5′-CCGCTCGAGGTGCAATTTCAGCTCAC TGCAAC-3′，反向引物序列：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTGACTTGATGG-3′。PCR的反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；隨后98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s以及68 ℃延伸110 s，重復(fù)30個循環(huán)；68 ℃最后延伸5 min。擴增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離并切膠回收。

1.2.2BC002811 重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定 使用限制性核酸內(nèi)切酶XhoⅠ和NotⅠ雙酶切BC002811全基因序列的PCR擴增產(chǎn)物以及pLVX-EGFP-IRES-neo載體，經(jīng)T4 DNA 連接酶16 ℃連接反應(yīng)2 h。連接產(chǎn)物隨后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)化后的菌液，接種至LB瓊脂培養(yǎng)基(含100 mg/L氨芐青霉素)，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。繼而，挑選抗性菌落轉(zhuǎn)移至液體LB培養(yǎng)基中進行擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定和瓊脂糖凝膠電泳檢測。最后，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送測序驗證。

1.2.3慢病毒包裝、濃縮及滴度測定 將重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-BC002811-EGFP-IRES-neo與pHelper 1.0及pHelper 2.0兩種病毒輔助包裝質(zhì)粒經(jīng)LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。8 h后，以DMEM完全培養(yǎng)基更換舊的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。1 000 r/min離心5 min收集病毒上清液，0.45 μm濾器過濾。再經(jīng)4 ℃、53 125 r/min高速離心和0.22 μm濾器過濾，收集病毒濃縮液，應(yīng)用倍比稀釋法測定病毒的滴度[4]。

1.2.4實時定量PCR (qPCR)檢測 TRIzol法抽提細(xì)胞總RNA；參照逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV說明書合成cDNA；以U6 snRNA為內(nèi)參照，qPCR檢測BC002811的表達水平。BC002811正向引物序列：5′-GATGAGAAAGCCAAGTTCCA-3′，反向引物序列：5′-GGTTGACAATCAGTATGGAC-3′；U6 snRNA正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min預(yù)變性；95 ℃、10 s變性，60 ℃、60 s退火及延伸，重復(fù)40個循環(huán)。參照2-△△Ct法計算BC002811相對表達水平。

1.2.5慢病毒感染HGC-27細(xì)胞 將HGC-27細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入2×104個細(xì)胞，常規(guī)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜。以100 μl完全培養(yǎng)基稀釋的病毒液更換舊培養(yǎng)基，再加入聚凝胺(終濃度為6 mg/L)，混勻后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。8 h后，棄舊培養(yǎng)基，加入不含聚凝胺的完全培養(yǎng)基。72 h后，熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。1～2周后，可將細(xì)胞轉(zhuǎn)至6 cm培養(yǎng)皿繼續(xù)擴大培養(yǎng)，然后構(gòu)建BC002811穩(wěn)定表達的細(xì)胞系。

1.2.6穩(wěn)定表達細(xì)胞系的構(gòu)建 取重組病毒感染的HGC-27細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞數(shù)濃度為(5～6)×104/L，以100 μl細(xì)胞懸液/孔接種于96孔板。有限稀釋法篩選單個細(xì)胞并能表達GFP的陽性孔，然后逐級擴大培養(yǎng)[5]。在此基礎(chǔ)上，qPCR檢測BC002811表達水平，進一步驗證穩(wěn)定表達細(xì)胞系是否構(gòu)建成功。

1.2.7MTS法檢測細(xì)胞增殖 取對照組和BC002811組的HGC-27細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種1×104個細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后分別加入10 μl MTS，繼續(xù)孵育4 h，以酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定吸光度(A490)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間均值比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增目的基因片段以BC002811的全基因序列作為模板，在引物中分別引入XhoⅠ和NotⅠ的酶切位點，進行PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，其PCR產(chǎn)物的條帶位于1 500～2 000 bp(見圖1)，大小與預(yù)期相符，表明已成功獲取了BC002811目的基因片段。

圖1 BC002811 PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

M1：1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2 ：BC002811全基因序列的PCR產(chǎn)物

2.2 重組慢病毒質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pLVX-BC002811-EGFP-IRES-neo轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取4個陽性克隆分別提取質(zhì)粒進行XhoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定。結(jié)果表明，2號和3號質(zhì)粒酶切后均可觀察到一條1 500～2 000 bp的目的條帶(見圖2)，電泳結(jié)果與理論值1 686 bp相符，初步鑒定質(zhì)粒正確。因此，選取2號和3號重組質(zhì)粒送測序驗證。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中插入的目的片段與BC002811基因序列完全一致，無堿基突變以及堿基插入、缺失等異常(見圖3)，表明BC002811慢病毒表達載體構(gòu)建成功。

2.3 慢病毒包裝及病毒滴度測定HEK293T細(xì)胞經(jīng)慢病毒包裝三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染后48 h，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞發(fā)出較強的綠色熒光(見圖4)，qPCR檢測顯示BC002811組質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的BC002811相對表達水平(1 352.94±84.82)較對照組(1.00±0.05)顯著升高(t=27.61，見圖5)，提示BC002811重組慢病毒質(zhì)粒可在HEK293T細(xì)胞中實現(xiàn)BC002811的高效表達。采用逐孔倍比稀釋法測定其病毒滴度為2.2×1011TU/L，表明慢病毒已包裝成功。

圖2 重組質(zhì)粒的XhoⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定

M1：1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；M2：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2、3、4：1號、2 號、3 號、4號陽性克隆菌落提取的重組質(zhì)粒；-：酶切前的質(zhì)粒；+：質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后的產(chǎn)物

圖3 重組慢病毒質(zhì)粒中BC002811插入片段的部分測序圖譜

2.4 建立穩(wěn)定表達BC002811的HGC-27胃癌細(xì)胞系經(jīng)有限稀釋法篩選，本項目組得到了穩(wěn)定表達BC002811的單克隆HGC-27細(xì)胞系。該細(xì)胞系與未經(jīng)處理的正常HGC-27細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上無明顯的差異，且能穩(wěn)定表達綠色熒光(見圖6)。qPCR結(jié)果表明，BC002811組細(xì)胞的BC002811相對表達水平(49.78±4.55)較對照組(1.00±0.07)明顯上調(diào)(t=18.57，見圖7)，提示穩(wěn)定表達BC002811的HGC-27胃癌細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.5 穩(wěn)定表達BC002811對HGC-27細(xì)胞增殖的影響由圖8可見，1、2、3、4、5 d，對照組細(xì)胞所測定的A490值分別為(0.58±0.02)、(0.90±0.02)、(1.35±0.15)、(1.81±0.13)、(2.12±0.17)，而BC002811組細(xì)胞的A490值分別為(0.66±0.02)、(1.11±0.11)、(1.79±0.14)、(2.54±0.29)、(3.02±0.32)，BC002811組細(xì)胞的A490值均高于對照組(P<0.05)，即上調(diào)BC002811表達可提高HGC-27細(xì)胞的增殖能力。

圖5 qPCR檢測HEK293T細(xì)胞中BC002811的表達水平

圖6 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定表達BC002811的HGC-27胃癌細(xì)胞系 ×100

圖7 qPCR檢測胃癌HGC-27穩(wěn)定表達細(xì)胞系中BC002811的表達水平

圖8 MTS法檢測穩(wěn)定表達BC002811對HGC-27細(xì)胞增殖的影響

3 討論

作為一種在非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本中片段長度最大的RNA分子，lncRNA具有基因表達調(diào)控的功能。與miRNA 相比，lncRNA的序列更長，攜帶的遺傳信息更為豐富，核苷酸分子通過折疊形成更為復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，可提供較大的空間位置與DNA、mRNA、miRNA以及蛋白質(zhì)等多種分子結(jié)合，故其分子調(diào)控機制也更加多樣化[6]。lncRNA與胃癌關(guān)系密切，在胃癌患者組織以及血漿標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)lncRNA的表達失調(diào)[2]。H19、HOTAIR、LINC00152、GAS5、MEG3等多種lncRNA具有致癌或抑癌活性，在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程均具有重要作用[2,6]。但目前對于lncRNA在胃癌中的作用及其分子機制的研究還比較少。由于基因組中l(wèi)ncRNA的數(shù)量龐大、調(diào)控方式多樣，因此絕大多數(shù)與胃癌相關(guān)的lncRNA其功能和作用機制仍不清楚，有待進一步研究。既往本項目組應(yīng)用lncRNA芯片技術(shù)對胃癌患者的lncRNA表達譜進行了探討，發(fā)現(xiàn)lncRNA BC002811在胃癌組織中呈明顯的表達上調(diào)[3]。BC002811是一種片段長度為1 686 bp的lncRNA，其基因在染色體上定位于17q25.1。近來的研究表明，BC002811表達水平與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及微血管密度呈正相關(guān)[7]。但目前尚無相關(guān)研究報道慢病毒所介導(dǎo)的BC002811過表達效應(yīng)及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

慢病毒是在人類免疫缺陷Ⅰ型(HIV-Ⅰ)病毒基礎(chǔ)上改造而成的一類病毒載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科；其可將自身的病毒RNA通過逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA ，然后整合到宿主細(xì)胞染色體，從而實現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)長期而穩(wěn)定地表達[8]。與質(zhì)粒以及腺病毒等其他病毒載體相比，慢病毒可感染分裂期及非分裂期細(xì)胞，具有感染效率高、轉(zhuǎn)移基因片段容量大(可容納10 kb左右的外源基因)、免疫原性弱和細(xì)胞毒性低等諸多優(yōu)點，是攜帶目的基因的理想載體[9]。為此，本研究選用慢病毒作為載體來攜帶BC002811基因，以實現(xiàn)BC002811在胃癌細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定地表達。HGC-27細(xì)胞來源于未分化胃腺癌組織，可分泌黏液素，惡性程度高，具有較強的體外增殖活性以及高侵襲、高轉(zhuǎn)移能力，是研究胃癌很好的細(xì)胞模型[10]。因此，本項目組選擇HGC-27細(xì)胞作為慢病毒感染的受體細(xì)胞來篩選穩(wěn)定表達BC002811的細(xì)胞系。

最近，本項目組的研究發(fā)現(xiàn)，通過慢病毒所介導(dǎo)的BC002811 shRNA載體靶向干擾BC002811表達，可抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖；提示BC002811具有潛在的促進胃癌細(xì)胞增殖的功能[11]。為了驗證這一結(jié)果，本項目組應(yīng)用慢病毒所介導(dǎo)的基因過表達技術(shù)在另一胃癌細(xì)胞系HGC-27中觀察了BC002811對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，BC002811過表達可提高HGC-27細(xì)胞的增殖活性，與上述研究結(jié)果相符。

綜上，本研究成功構(gòu)建了BC002811的重組慢病毒載體，并建立了BC002811穩(wěn)定表達的HGC-27胃癌細(xì)胞系。BC002811過表達后， HGC-27細(xì)胞的增殖能力增強。因此，本研究為后續(xù)進一步探討B(tài)C002811在胃癌中的生物學(xué)功能及其作用機制奠定了基礎(chǔ)。