喬義強(qiáng)，李亞芳，王 早，胡瑞巧

上頜快速擴(kuò)弓(rapid maxillary expansion，RME)是指對(duì)腭中縫施加機(jī)械牽張力以擴(kuò)寬牙弓，常用于治療上頜骨橫向發(fā)育不足[1]。骨縫的機(jī)械性擴(kuò)張常伴隨不同程度的復(fù)發(fā)，其中一個(gè)重要的復(fù)發(fā)原因就是腭中縫尚未形成足夠的新生骨質(zhì)[2]。目前防止復(fù)發(fā)的有效方法之一是長(zhǎng)時(shí)間保持[3],但這就延長(zhǎng)了患者的治療周期，所以如果能通過某種途徑促進(jìn)成骨，就會(huì)減少骨縫擴(kuò)大后的復(fù)發(fā)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在骨改建的過程中發(fā)揮了非常重要的作用[4]；Wnt/β-catenin信號(hào)通路在生物生命活動(dòng)中的作用，得到越來越多的關(guān)注，然而目前研究對(duì)骨代謝的調(diào)控作用，多集中于NF-κB或Wnt/β-catenin信號(hào)通路里的一種；有研究表明人類腭中縫牽張成骨中成骨方式，與大鼠前腭縫前部相似，且腭中縫前部礦化時(shí)間多于后部[5]。因此，該實(shí)驗(yàn)在兩個(gè)信號(hào)通路研究的基礎(chǔ)上，提出了NF-κB與Wnt/β-catenin通道交叉調(diào)控大鼠前腭縫牽張成骨，通過建立大鼠前腭縫牽張模型，初步探討兩個(gè)通路交叉調(diào)控大鼠前腭縫牽張成骨的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選用45只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量(280±20) g[購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)SCXK(魯)20140007]，在標(biāo)準(zhǔn)溫度和濕度的條件下喂養(yǎng)，大鼠自由進(jìn)食和飲水。將大鼠分為對(duì)照組、擴(kuò)弓組、SB組，每組15只。

1.2 建立大鼠前腭縫擴(kuò)張模型擴(kuò)弓組、SB組大鼠10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔麻醉后，上頜中切牙裝擴(kuò)大簧，用0.016英寸澳絲彎制擴(kuò)大簧，力量在(200±10)g，裝擴(kuò)大簧后SB組大鼠在前腭縫注射β-catenin激動(dòng)劑SB-415286(美國Sigma公司)，1 mg/kg/d，將其稀釋于DMSO中，對(duì)照組、擴(kuò)弓組大鼠注射等劑量的賦形劑DMSO。3組大鼠分別于擴(kuò)弓1、4、7 d后，腹腔注射過量水合氯醛處死，每次每組處死5只。

1.3 標(biāo)本的處理與染色大鼠處死后即刻取標(biāo)本。10%福爾馬林固定，次日使用高分辨率Micro-CT (SKYSCAN1272，比利時(shí)Bruker公司)進(jìn)行掃描。 EDTA脫鈣后石蠟包埋切片，進(jìn)行HE、Masson染色觀察前腭縫組織形態(tài)學(xué)改變，IHC染色觀察相關(guān)因子的變化并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對(duì)成骨因子的表達(dá)量進(jìn)行IOD分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0軟件包，進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠的體質(zhì)量變化情況實(shí)驗(yàn)期間，擴(kuò)弓組、SB組大鼠對(duì)擴(kuò)大簧耐受良好，3 組大鼠均未出現(xiàn)黏膜感染、死亡等意外情況，符合本實(shí)驗(yàn)的要求。對(duì)照組大鼠平均體質(zhì)量隨天數(shù)增加而穩(wěn)步增加，擴(kuò)弓組、SB組大鼠平均體質(zhì)量在擴(kuò)弓第1、2天下降，第3天后開始恢復(fù)增長(zhǎng)(圖1)。擴(kuò)弓組、SB組大鼠的平均體質(zhì)量均小于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而擴(kuò)弓組與SB組大鼠之間平均體質(zhì)量的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠的體質(zhì)量變化情況

2.2 Micro-CT 影像下大鼠前腭縫寬度的變化圖2中觀察到對(duì)照組大鼠前腭縫形態(tài)無明顯改變，擴(kuò)弓組、SB組大鼠第4天開始前腭縫寬度明顯增加，并且在骨縫中央可見小的指狀突起，到第7天前腭縫寬度進(jìn)一步增加，指狀突起數(shù)量與長(zhǎng)度都明顯增加。表1比較了3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間前腭縫寬度的變化，與對(duì)照組相比，擴(kuò)弓組、SB組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)前腭縫寬度均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，然而，擴(kuò)弓組、SB組之間寬度的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間3組大鼠上頜前腭縫Micro-CT影像

2.3 大鼠前腭縫組織學(xué)改變對(duì)照組大鼠的前腭縫主要由腭骨邊緣覆蓋的軟骨細(xì)胞層及中間的纖維組織構(gòu)成，成骨細(xì)胞沿著骨縫兩側(cè)稀疏排列。 擴(kuò)弓組、SB組大鼠第4天可觀察到前腭縫變寬，邊緣有新生類骨質(zhì)生成，呈指狀突起，體積較大的成骨細(xì)胞呈層疊狀排列，覆蓋在新生類骨質(zhì)上。加力7 d后，新骨形成明顯呈指狀，兩側(cè)部分長(zhǎng)的指狀新骨交叉重疊，骨邊緣及類骨質(zhì)中的成骨細(xì)胞也明顯增多(圖3A)，縫中間的膠原纖維沿著擴(kuò)張力的方向平行排列(圖3B)。

2.4 免疫組化結(jié)果

2.4.1NF-κB p65與β-catenin表達(dá)情況 NF-κB p65與β-catenin在對(duì)照組中很少表達(dá)，在擴(kuò)弓組、SB組大鼠沿著前腭縫積聚的成骨細(xì)胞中，可觀察到強(qiáng)烈的NF-κB p65與β-catenin表達(dá)。 擴(kuò)弓組、SB組NF-κB表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，SB組NF-κB表達(dá)相對(duì)弱于擴(kuò)弓組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖4A)；與擴(kuò)弓組相比，SB組前腭縫中β-catenin的表達(dá)明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05, 圖4B)。

表1 實(shí)驗(yàn)期間3組大鼠上頜前腭縫寬度的變化(μm)

與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較：*P<0.05

圖3 3組大鼠不同天數(shù)上頜前腭縫 ×20A：HE染色 ；B：Masson染色

2.4.2BMP-2的表達(dá)情況 光鏡下觀察對(duì)照組大鼠前腭縫，少量成骨細(xì)胞沿上頜骨邊緣不連續(xù)分布。擴(kuò)弓組、SB組大鼠前腭縫中BMP-2陽性成骨細(xì)胞呈梭形，并連續(xù)覆蓋新形成的指狀突起表面(圖5A)。與對(duì)照組大鼠相比，擴(kuò)弓組、SB組大鼠切片中BMP-2的IOD值從第1天開始顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)比較擴(kuò)弓組、SB組大鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)SB組大鼠上頜前腭縫組織中BMP-2的IOD值比擴(kuò)弓組大鼠的高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6A)。

2.4.3OCN的表達(dá)情況 光鏡下觀察OCN免疫組化染色結(jié)果與BMP-2呈類似趨勢(shì)，且更加明顯。對(duì)照組大鼠上頜前腭縫無明顯OCN陽性細(xì)胞，而擴(kuò)弓組、SB組大鼠上頜前腭縫區(qū)域OCN陽性細(xì)胞明顯增多，第7天，SB組大鼠可看到棕色顆粒大量層疊狀出現(xiàn)在上頜骨前腭縫及指狀突起表面(圖5B)。擴(kuò)弓組、SB組大鼠上頜前腭縫組織中OCN的IOD值在擴(kuò)弓4、7 d后顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與擴(kuò)弓組大鼠相比，SB組大鼠上頜前腭縫組織中OCN的IOD值比擴(kuò)弓組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6B)。

圖4 3組大鼠 NF-κB p65、β-catenin免疫組化染色的IOD值

A：NF-κB p65；B：β-catenin；與對(duì)照組相比：*P<0.05，**P<0.01；與擴(kuò)弓組相比：#P<0.05，##P<0.01

圖5 3組大鼠上頜前腭縫BMP-2、OCN免疫組織化學(xué)染色 ×20A：BMP-2；B：OCN

圖6 3組大鼠BMP-2、OCN免疫組化染色的IOD值

A：BMP-2；B：OCN；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與擴(kuò)弓組比較：#P<0.05

3 討論

從兒童、青少年到年輕成人，上頜擴(kuò)弓可有效地解決上頜骨橫向不足的問題[6]，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)年輕成年SD大鼠的擴(kuò)弓實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)大簧可以成功擴(kuò)開大鼠上頜骨前腭縫，通過對(duì)Micro-CT和HE組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)前腭縫增寬，新骨在前腭縫成指狀結(jié)構(gòu)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，新形成的指狀骨是薄而長(zhǎng)，這一發(fā)現(xiàn)提醒我們?cè)谶M(jìn)行上頜橫向擴(kuò)張的過程中，特別是在擴(kuò)張?jiān)缙?，要注意力的大小，若力過大，可能影響成骨作用導(dǎo)致骨吸收。

有實(shí)驗(yàn)表明，機(jī)械力刺激能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，激活細(xì)胞中多種相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)新骨形成[7]。本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)弓組、SB組大鼠前腭縫及新生骨表面呈層疊狀排列著大量成骨細(xì)胞，邊緣新生骨基質(zhì)形成，顯示出活躍的成骨活動(dòng)，前腭縫結(jié)締組織內(nèi)還可見大量的成纖維細(xì)胞，膠原纖維沿著擴(kuò)張力的方向排列。這與先前的研究結(jié)果相一致。

Wnt信號(hào)通路可對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的成熟、分化和凋亡過程進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而維持機(jī)體骨代謝平衡[8]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵下游成分，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，大鼠前腭縫受牽張力作用時(shí)，成骨細(xì)胞β-catenin表達(dá)增加，新骨形成增多[9]。實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)弓組、SB組大鼠前腭縫中β-catenin呈強(qiáng)陽性在成骨細(xì)胞中表達(dá)。這些結(jié)果與先前的報(bào)道一致，表明機(jī)械力可激活大鼠上頜骨前腭縫成骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路，增加β-catenin表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)使用β-catenin激動(dòng)劑SB-415286，抑制了β-catenin的降解，SB組大鼠β-catenin在前腭縫周圍及新骨內(nèi)表達(dá)更加顯著。

有學(xué)者在驗(yàn)證機(jī)械張力通過NF-κB途徑對(duì)成骨作用的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)機(jī)械張力能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)、核易位以及與DNA結(jié)合活性[10]。在機(jī)械力作用下，成骨細(xì)胞NF-κB通路被激活，增加了關(guān)鍵成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx 2的表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)弓組、SB組大鼠在前腭縫周圍以及新骨內(nèi)積聚的成骨細(xì)胞中，可觀察到強(qiáng)烈的p65表達(dá)，表明NF-κB通路被激活，驗(yàn)證了先前的研究，證明了機(jī)械張力可激活大鼠前腭縫成骨細(xì)胞中NF-κB通路。而SB組NF-κB p65表達(dá)相對(duì)弱于擴(kuò)弓組大鼠，表明使用β-catenin激動(dòng)劑抑制了NF-κB活性。

BMP-2參與牙齒移動(dòng)、上頜擴(kuò)弓等矯治過程中的骨代謝和骨改建[12]，有研究發(fā)現(xiàn)，在正畸過程中，BMP-2形成增多，并參與其中的骨吸收、骨形成[13]。本實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)弓組大鼠上頜前腭縫BMP-2的IOD值較對(duì)照組顯著增大(P<0.05)，證明了機(jī)械擴(kuò)張力可以促進(jìn)大鼠前腭縫BMP-2的表達(dá)。OCN是另一個(gè)重要的成骨因子,多存在于成骨細(xì)胞及其分泌的骨基質(zhì)中，既是成骨細(xì)胞分化、成熟的標(biāo)志，也是骨形成的重要標(biāo)志，主要存在于成骨細(xì)胞及其分泌的骨基質(zhì)當(dāng)中。在此次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比， 擴(kuò)弓組、SB組大鼠的OCN表達(dá)量在第4、7天均升高。在注射β-catenin激動(dòng)劑后，NF-κB活性受到抑制，SB組大鼠BMP-2、OCN的表達(dá)量明顯高于擴(kuò)弓組和對(duì)照組，與Chang et al的研究一致，抑制NF-κB活性可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨作用[11]。

綜上，機(jī)械牽張力可激活SD大鼠前腭縫組織中NF-κB與Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)骨改建活動(dòng)。使用β-catenin激動(dòng)劑進(jìn)一步激活Wnt/β-catenin通路，下調(diào)了NF-κB p65，抑制了NF-κB活性，成骨因子BMP-2、OCN表達(dá)增多，加速了上頜骨前腭縫新骨的形成與鈣化沉積，將有利于縮短RME療程，有利于降低矯治后復(fù)發(fā)率，對(duì)臨床具有一定的指導(dǎo)意義。