謝曉娟，金 燕，王 靜，蘭金蘋，武彩霞，劉 宇，劉開揚

肺癌是當前全球發(fā)病率及死亡率排名前列的惡性腫瘤，對于肺癌的控制與治療已成為全社會普遍關注的問題[1]。溶瘤病毒治療腫瘤以其副作用小、療效顯著被研究者普遍接受[2]。新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)屬于溶瘤病毒的一種[3]，對人類的正常細胞無殺傷作用但對腫瘤細胞具有特異性的殺傷作用[4-5]，課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，NDV HBNU/LSRC/F3株(NDV F3)對于一些消化道腫瘤細胞[6-7]有明顯的誘導凋亡作用，而此凋亡過程是否與細胞關鍵結(jié)構(gòu)微絲骨架相關尚未見報道。鑒于NDV為呼吸道病毒，該研究應用NDV F3株感染非小細胞肺癌NCI-H1299細胞，以期探究NDV對NCI-H1299細胞的影響及其與細胞微絲骨架的關系。

1 材料與方法

1.1 材料人非小細胞肺癌細胞株NCI-H1299及NDV F3株由河北北方學院生命科學研究中心分子病毒室保存。RPMI-1640基礎培養(yǎng)基、胰酶及細胞松弛素D(Cytochalasin D)購自美國Gibco公司；胎牛血清購自上海ExCell Bio公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；Annexin V/PI雙染色法凋亡試劑盒及Matrigel膠購自美國BD公司；抗體GAPDH購自武漢ABclonal公司；F-actin、RhoA、ROCK2、P-MYPT1及辣根過氧化物酶標記二抗購自北京博奧森公司；Transwell 3422購自美國康寧公司；流式細胞儀購自美國BD公司；掃描電鏡購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) NDV F3原液復感染指數(shù)(multiplicity of infection， MOI)值為100，將RPMI-1640培養(yǎng)基維持液稀釋的NDV F3，稀釋為不同MOI值(MOI=10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01)；NCI-H1299細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞長至瓶底近80% 時，實驗組加入0.5 ml RPMI-1640基礎培養(yǎng)基稀釋的NDV F3(MOI=1)感染的尿囊液，吸附1 h，加RPMI-1640基礎培養(yǎng)基4.5 ml，使MOI最終為0.1。陰性對照組加入同樣方式稀釋的正常尿囊液。3個重復，培養(yǎng)至12、24、36、48、60 h 5個時相點，觀察拍照。

1.2.2掃描電鏡下觀察不同藥物及病毒作用后微絲骨架等超微結(jié)構(gòu)改變 細胞爬片，調(diào)整細胞濃度為1×104/ml，待細胞長至對數(shù)生長期，實驗組加入1 ml NDV F3(終濃度為MOI=0.1)；陰性對照組加入1 ml正常尿囊液；陽性對照組加入濃度為10 mg/ml的5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil, 5-FU)；Cytochalasin D組加入濃度為5 μmol/ml Cytochalasin D，培養(yǎng)24 h。設3個重復。24 h后加入戊二醛固定4 h，PBS洗3次，每次10 min。梯度乙醇脫水，叔丁醇置換2次，每次10 min，干燥、噴金后觀察并拍照。

1.2.3CCK-8法檢測NDV對NCI-H1299細胞增殖能力的影響 選取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化離心計數(shù)為1×104個/ml，種入96孔板，每孔200 μl，培養(yǎng)不同時相點，加入RPMI-1640無血清培養(yǎng)基稀釋的不同MOI的NDV F3 200 μl(MOI= 1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01)，對照組加入200 μl同樣稀釋方式的正常尿囊液，設3個重復，培養(yǎng)至各時相點后加入20 μl CCK-8試劑，4 h后，酶標儀450 nm波長下檢測其OD值。

抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%

1.2.4流式細胞儀檢測NDV對NCI-H1299細胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期NCI-H1299細胞，對照組為正常細胞，實驗組加入NDV F3(終濃度為MOI=0.1)，分別培養(yǎng)12、18、24 h后收集細胞并離心，冷PBS洗2次，計數(shù)至1×104個/ml。按Annexin V/PI雙染色法凋亡試劑盒說明書操作，檢測凋亡率。

1.2.5Western blot 檢測NDV對NCI-H1299細胞蛋白表達的影響 取對數(shù)生長期細胞實驗組加入NDV F3(終濃度MOI=0.1)，培養(yǎng)24 、36、48 h后提取蛋白，對照組為正常細胞，根據(jù)蛋白定量結(jié)果加入樣品。經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、用5%奶粉封閉1 h、加入一抗4 ℃過夜、洗膜、加入二抗室溫孵育2 h、再洗膜、檢測拍照。GAPDH為內(nèi)參使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

1.2.6細胞劃痕試驗觀察細胞感染病毒對其遷移能力的影響 細胞消化離心后計數(shù)至1×104/ml，接種于6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h， 待細胞進入對數(shù)生長期后，用RPMI-1640基礎培養(yǎng)基洗3次，對照組用10 μl槍頭在孔中心劃一道直線，RPMI-1640培養(yǎng)基洗3次，對照組加入正常尿囊液；NDV-F3組加入終濃度MOI為0.1的NDV F3；5-FU組加入濃度為10 mg/ml的5-FU，培養(yǎng)48 h。分別在0、48 h拍照，每組設3個平行孔，測量兩側(cè)細胞間劃痕距離，比較各組間劃痕愈合的差異。

1.2.7Transwell試驗觀察病毒感染細胞后對其遷移能力的影響 Matrigel膠融化后用RPMI-1640基礎培養(yǎng)基按1 ∶3稀釋。Transwell板提前預冷，每孔加入50 μl稀釋后的Matrigel膠，37 ℃放置1 h。細胞接種前用RPMI-1640基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h去除血清對其影響，細胞消化離心計數(shù)至1×104個/ml，用MOI為0.1的NDV重懸細胞，每個小室中加入200 μl重懸細胞，下室加入含10%胎牛血清的RPMI-1640基礎培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，PBS洗2次，多聚甲醛固定15 min，PBS輕洗1次，棉簽輕輕擦去小室內(nèi)的細胞，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3次，風干后拍照。

2 結(jié)果

2.1 NDV感染人非小細胞肺癌NCI-H1299后細胞形態(tài)、數(shù)量及狀態(tài)的改變對照組正常NCI-H1299細胞貼壁情況佳，形態(tài)正常，呈典型的上皮細胞型，鋪石狀，各細胞間邊界清晰，有折光性；NDV感染12 h后，細胞折光性變差， 包漿中出現(xiàn)顆粒狀物質(zhì)，細胞間隙模糊；感染24 h后，細胞失去正常形態(tài)，細胞間隙更加模糊，細胞融合現(xiàn)象明顯，瓶中出現(xiàn)懸浮死細胞，細胞失去折光性；感染36 h后，隨感染時間的增加，胞漿中顆粒性物質(zhì)增多，貼壁細胞逐漸減少，培養(yǎng)液中可見大量死細胞及細胞碎片；感染48 h后，死細胞進一步增多；感染60 h時，視野下幾乎全為懸浮的死細胞和細胞碎片。見圖1。

圖1 普通倒置顯微鏡觀察NDV感染NC1-H1299后細胞形態(tài) ×100

A：對照組細胞；B：NDV F3感染細胞12 h；C：NDV F3感染細胞24 h；D：NDV F3感染細胞36 h；E：NDV F3感染細胞48 h；F：NDV F3感染細胞60 h

2.2 掃描電鏡觀察結(jié)果結(jié)果顯示NDV與Cytochalasin D、5-FU都對細胞微絲骨架有極大的破壞作用。陰性對照組正常NCI-H1299細胞微絨毛纖長，包覆于整個細胞表面，細胞間界限清晰，細胞表面結(jié)構(gòu)正常。NDV F3作用后，相鄰細胞間的界限模糊甚至消失，細胞微絨毛變短，部分發(fā)生膨大甚至出現(xiàn)脫落斷裂；微絲解聚陽性對照Cytochalasin D處理組細胞出現(xiàn)微絨毛的脫落斷裂，細胞間間隙模糊，并且細胞表面出現(xiàn)空洞；陽性對照5-FU處理組細胞表面微絨毛脫落，表面粗糙。見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察細胞 ×4 000

A：對照組細胞；B：NDV F3感染細胞24 h；C：Cytochalasin D 作用24 h；D：5-FU作用24 h

2.3 CCK-8法結(jié)果NDV F3對NCI-H1299細胞有顯著的抑制作用，其作用呈濃度和時間的依賴性遞增。其中NDV F3(MOI=0.1)抑制作用最佳，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 NDV感染NCI-H1299細胞后抑制率的影響與對照組比較：*P<0.05

2.4 流式細胞術分析早期凋亡結(jié)果NDV可誘導NCI-H1299細胞凋亡，病毒感染12 h，凋亡率為(8.20±2.36)%；感染18 h，凋亡率為(14.27±1.00)%；感染24 h，凋亡率為(18.3±0.56)%。與對照組(0.21±0.11)%相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 流式細胞儀檢測NDV作用后NCI-H1299細胞凋亡的影響

A：對照組；B：NDV F3感染細胞12 h；C：NDV F3感染細胞18 h；D：NDV F3感染細胞24 h；E：凋亡率柱狀圖；與對照組比較：**P<0.01

2.5 Western blot蛋白表達結(jié)果結(jié)果發(fā)現(xiàn)NCI-H1299細胞隨感染NDV F3(MOI=0.1)時間的延長，RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表達水平均發(fā)生下調(diào)(P<0.05)，F(xiàn)-actin及RhoA蛋白表達在24 h時出現(xiàn)明顯下降，而ROCK2及P-MYPT1蛋白表達在36 h時出現(xiàn)明顯下降。見圖5。

2.6 細胞劃痕試驗結(jié)果NDV F3組細胞遷移率為(0.091±0.729)%；5-FU組細胞遷移率為(0.135±0.005)%；與對照組細胞遷移率(0.351±0.029)%比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。NCI-H1299感染NDV F3后其劃痕愈合速度與對照組相比明顯減慢，遷移率與對照組及5-FU組相比顯著降低，并且NDV F3對NCI-H1299細胞遷移作用的影響比抗癌藥物5-FU更顯著。見圖6。

圖5 Western blot分析NCI-H1299細胞F-actin、P-MYPT1、RhoA、ROCK2蛋白表達

A：蛋白表達結(jié)果；B：F-actin；C：P-MYPT1；D：RhoA；E：ROCK2；與對照組比較：*P<0.05

圖6 劃痕試驗結(jié)果

A：各組細胞劃痕后間距變化×100；B: 各組細胞劃痕后遷移率；與對照組比較：**P<0.01

2.7 Transwell試驗結(jié)果對照組穿膜細胞較多，感染NDV F3后穿膜細胞減少，遷移細胞數(shù)降低。見圖7。

圖7 Transwell試驗結(jié)果 結(jié)晶紫染色 ×100與對照組比較：**P<0.01

3 討論

微絲骨架為支撐細胞形態(tài)和促進細胞運動的關鍵結(jié)構(gòu)，調(diào)控細胞的運動、分裂、攝粒和排粒，并且影響軸突的物質(zhì)運輸。其結(jié)構(gòu)呈纖維網(wǎng)狀，主要由微管、中等纖維、微絲等結(jié)構(gòu)組成。近年研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，微絲骨架與細胞凋亡關系密切，骨架的主要成分微絲、微管出現(xiàn)解聚或聚合異常以及中間絲的結(jié)構(gòu)破壞，都會導致凋亡的發(fā)生。細胞發(fā)生凋亡時，細胞骨架內(nèi)的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，細胞骨架重組，形成凋亡微管網(wǎng)及凋亡小體，影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。有學者在研究HL-60細胞微絲骨架時發(fā)現(xiàn)，微絲的解聚與細胞凋亡有關[10]。

RhoA/ROCK信號通路與微絲骨架改變關系密切，它主要與F-actin結(jié)構(gòu)的形成相關，主要過程為RhoA與GTP酶結(jié)合后，活化下游的ROCK(ROCK1和ROCK2結(jié)構(gòu)域近90%同源性)，進一步磷酸化相同底物：肌球蛋白輕鏈(MLC)和肌球蛋白磷酸酶亞基1(MYPT1)，從而造成一些效應分子的改變，形成微絲、偽足等F-actin結(jié)構(gòu)[11]。RhoA/ROCK信號通路在調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的降解、合成、收縮和移動方面發(fā)揮著重要的作用，也與細胞骨架的重建、細胞極性的改變有著密切的關系，并影響腫瘤基因的變化[12]。其中RhoA與應力纖維及黏著斑的形成有關并影響微絲骨架的組建。有研究[13]表明，RhoA在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。ROCK是Rho蛋白重要的下游效應器，介導下游MLC及MYPT1磷酸化水平，從而影響肌動蛋白、肌球蛋白的交聯(lián)程度以及肌動蛋白微絲骨架的聚合來調(diào)控細胞遷移、形態(tài)改變，微絲骨架重組等多種生物學行為。有學者在研究膀胱癌患者中發(fā)現(xiàn)，RhoA與ROCK的表達與腫瘤的級別成正相關[11]，RhoA與ROCK都能夠影響微絲骨架的形成與重組，進而影響腫瘤細胞的增殖和遷移，并且MYPT1的磷酸化水平與他們活性成正相關。F-actin為微絲蛋白的多聚體，它的重組影響著細胞的形態(tài)以及運動、遷移。F-actin結(jié)構(gòu)破壞，使得細胞間的連接減少，信號的傳遞功能減弱；應力纖維受損，使得細胞抵御外界壓力的能力降低，影響細胞的生長[14]。該研究表明RhoA、ROCK2、F-actin、P-MYPT1蛋白表達水平均發(fā)生下調(diào)。這些蛋白表達的下調(diào)可能因為隨著NDV F3作用時間的延長，抑制RhoA與ROCK2蛋白活性，造成其表達發(fā)生下調(diào)，從而影響下游的MYPT1的磷酸化，造成其磷酸化水平降低，進一步影響應力纖維、微絲等F-actin結(jié)構(gòu)的形成，使得F-actin表達降低。此結(jié)果證實了NDV F3誘導NCI-H1299細胞凋亡可能與RhoA/ROCK通路有關。

F-actin結(jié)構(gòu)的組成與細胞形態(tài)以及細胞運動、遷移有著密切關系，通過形態(tài)學觀察病毒感染后細胞表面結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)細胞微絨毛發(fā)生膨大斷裂等現(xiàn)象，這種改變可能由于NDV F3株破壞細胞微絲結(jié)構(gòu)，造成內(nèi)部結(jié)構(gòu)消失而形成。使用CCK-8法及流式細胞術檢測到NDV F3株對NCI-H1299有抑制及誘導凋亡的作用。F-actin改變不僅與細胞凋亡相關，也可影響腫瘤細胞侵襲遷移能力，其中基質(zhì)金屬蛋白酶類發(fā)揮著重要的作用，它能夠分解細胞外基質(zhì)，使得細胞更容易侵襲和轉(zhuǎn)移，通過在細胞小室中加入人工細胞外基質(zhì)，觀察通過小室的細胞數(shù)，檢測細胞的侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NDV F3具有抑制NCI-H1299細胞侵襲遷移的作用。