王玉涵,展 凡,程 卉,鄭 鳳,謝忠穩(wěn),李慶林
(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)科研實驗中心 新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,安徽 合肥 230038; 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物資源與利用國家重點實驗室,安徽 合肥 230031)
肝纖維化是對慢性肝損傷的創(chuàng)傷愈合反應(yīng),是大多數(shù)慢性肝病的一個主要特征,反映了肝臟修復(fù)與瘢痕形成之間的平衡[1]。隨著損傷時間的延長,肝纖維化可發(fā)展為過度瘢痕和器官衰竭,如肝硬化和原發(fā)性肝癌,嚴(yán)重威脅人類健康[2]。在此過程中,細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)合成增加,降解減少而使得ECM過度沉積;肝纖維化中多種細胞類型被認為是ECM的來源,而肝星狀細胞是肝損傷后產(chǎn)生ECM的主要細胞。目前為止,雖然治療肝纖維化的藥物種類繁多[3],但大多數(shù)藥物的不良反應(yīng)大,治療效果不理想。近年來,中藥治療肝纖維化成為研究的熱點[4-5]。表兒茶素屬黃烷醇類化合物,廣泛存在于茶葉、可可、葡萄等植物中,也可見于多種中藥如兒茶、山楂、何首烏、鉤藤[6-8]。大量研究表明,表兒茶素具有抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護等多種藥理活性[9-11]。Cheng H等[12]研究表明,表兒茶素對非酒精性脂肪肝具有明顯的預(yù)防作用。但是表兒茶素干預(yù)肝纖維化的作用及其機制目前尚未見研究報道。本研究通過腹腔注射四氯化碳(CCl4)建立大鼠肝纖維化模型,觀察表兒茶素對大鼠肝纖維化的影響,為表兒茶素的應(yīng)用提供可能的理論依據(jù)。
1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠,體質(zhì)量180~220 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0011]。
1.2 藥物與試劑 表兒茶素(純度>98.0%,C15H14O6,MW=290.27):南京植佰萃生物科技有限公司;陽性對照藥為秋水仙堿(批號 20150312)、CCl4(批號 20181010):北京國藥集團;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒(批號 20181222)、Masson染色試劑盒(批號 201910103)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測試劑盒(批號 20190111)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒(批號 20190112):南京建成生物工程研究所;平滑肌肌動蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)抗體(E-AB-34268)、Ⅰ型膠原(typeⅠcollagen,collα1)抗體(E-AB-70008):武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。
1.3 主要儀器 低速離心機:德國Eppendorf公司;多功能酶標(biāo)儀:美國MD公司;凝膠成像系統(tǒng):美國ProteinSimple;電子精密天平:奧多利斯科學(xué)儀器有限公司;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS公司。
2.1 動物模型的復(fù)制、分組及給藥 根據(jù)馬冬梅等[13]的方法復(fù)制肝纖維化大鼠模型。雄性SD大鼠80只,SPF級。實驗室飼養(yǎng)1周后,隨機分為6組,分別為正常對照組、模型組(CCl4)、秋水仙堿組(CCl4+秋水仙堿)、表兒茶素高劑量組、表兒茶素低劑量組,組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義。正常對照組10只,其余每組14只,除正常對照組腹腔注射橄欖油溶液外,其余各組大鼠腹腔注射30% CCl4橄欖油復(fù)制肝纖維化模型,首次3 mL/kg,以后每次2 mL/kg,每周2次,連續(xù)6周,直至動物處死前一天。模型復(fù)制次日開始灌胃給藥,秋水仙堿組按照每日0.1 mg/kg的劑量給予秋水仙堿;表兒茶素高劑量組按照每日100 mg/kg的劑量灌胃給予表兒茶素;表兒茶素低劑量組按照每日25 mg/kg的劑量灌胃給予表兒茶素;正常對照組和模型組給予同容積生理鹽水,每日1次,持續(xù)6周,末次給藥后禁食不禁水24 h,大鼠麻醉后腹主動脈取血,離心分離血清,-20 ℃保存。各組大鼠處死后取肝臟,稱量肝濕質(zhì)量,切取肝左葉邊緣相同部位置于10%甲醛溶液固定,用作組織病理學(xué)觀察,另一部分于-80 ℃保存。
2.2 計算肝臟指數(shù) 肝臟指數(shù)計算公式:肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。
2.3 血清ALT和AST水平測定 離心分離血清,按照ALT及AST試劑盒上說明,微板法檢測大鼠血清中ALT及AST含量,評價大鼠肝功能。
2.4 肝臟組織病理學(xué)觀察 用10%中性甲醛固定肝臟后,經(jīng)梯度濃度乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、切成4 μm厚的病理組織片后,常規(guī)HE染色,評價肝組織病理學(xué)狀態(tài)。Masson染色,觀察肝臟纖維化程度。
2.5 Western blot法檢測肝臟中α-SMA、collα1蛋白的表達水平 將肝組織切成小塊,在冰上用放射免疫沉淀分析(radio-immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液提取蛋白。在4 ℃以12 000 r/min離心樣品10 min。通過聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid,BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒測量總蛋白質(zhì)的濃度。通過十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肝組織裂解物樣品,然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)上。在一抗(1∶1 000)與4 ℃溫育過夜后,將膜洗滌3次,然后與二抗溫育2 h。通過三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖鹽溶液和吐溫(tris-buffered saline and tween 20,TBST)將膜洗滌3次并分析定量。目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參的灰度值以校正誤差,所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對表達量。
3.1 表兒茶素對肝纖維化大鼠肝臟指數(shù)的影響 與正常對照組相比,模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組相比,表兒茶素各劑量組、秋水仙堿組大鼠的肝臟指數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但表兒茶素各劑量組與秋水仙堿組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示表兒茶素具有改善肝臟指數(shù)的作用。見圖1。
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組;與正常對照組比較,#P<0.05,與模型組比較,*P<0.05
3.2 表兒茶素對大鼠肝功能的影響 與正常對照組相比,模型組大鼠血清中ALT和AST活性顯著升高(P<0.05);與模型組相比,表兒茶素各劑量組、秋水仙堿組大鼠血清中ALT和AST的水平顯著降低(P<0.05),但表兒茶素各劑量組與秋水仙堿組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示表兒茶素具有改善大鼠肝功能的作用。見圖2。
3.3 表兒茶素對肝組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果(見圖3)顯示:正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整,肝索排列整齊,呈放射狀排列,肝細胞大小均勻,無炎癥細胞變性及壞死。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝的正常結(jié)構(gòu)遭到破壞,肝細胞出現(xiàn)氣球樣變,可見明顯壞死的肝細胞及大量炎癥細胞浸潤,肝匯管區(qū)出現(xiàn)膠原纖維沉積。秋水仙堿組和表兒茶素高、低劑量組大鼠肝細胞損傷程度均有明顯減輕,且秋水仙堿組和表兒茶素高劑量組效果較好,肝細胞脂肪變性及壞死顯著減少,細胞炎癥明顯減輕。Masson染色結(jié)果(見圖4)顯示,正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常,僅在中央靜脈及匯管區(qū)有極少量膠原纖維存在。模型組大鼠肝臟匯管區(qū)有大量粗大的膠原纖維增生,呈寬帶狀增生的膠原纖維形成條索狀纖維分隔,導(dǎo)致正常的肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞,形成了假小葉。秋水仙堿組及表兒茶素高、低劑量組肝組織中膠原纖維顯著減少,肝小葉結(jié)構(gòu)也有不同程度的恢復(fù),且秋水仙堿組和表兒茶素高劑量組恢復(fù)較為顯著。
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組;與正常對照組比較,#P<0.05,與模型組比較,*P<0.05
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組
圖3各組大鼠肝組織形態(tài)變化(HE染色,10×40倍)
3.4 表兒茶素對大鼠肝臟中α-SMA、collα1蛋白表達的影響 與正常對照組比較,模型組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,表兒茶素高、低劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);另外,與秋水仙堿組比較,表兒茶素低劑量組大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達量顯著升高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而表兒茶素高劑量組與秋水仙堿組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),提示表兒茶素能夠降低大鼠肝組織中α-SMA、collα1蛋白的相對表達水平,且表兒茶素高劑量組的效果較明顯。見圖5、圖6。
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組
圖4各組大鼠肝組織形態(tài)變化(Masson染色,10×40倍)
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組
圖5Westernblot法檢測肝臟中α-SMA、
collα1蛋白表達水平
注:A.正常對照組;B.模型組;C.秋水仙堿組;D.表兒茶素高劑量組;E.表兒茶素低劑量組;與正常對照組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05;與秋水仙堿組比較,◇P<0.05
肝纖維化是機體對各種致病因子引起肝臟持續(xù)性損傷后,肝組織自我修復(fù)的代償反應(yīng),是各種慢性肝病的共同病理過程,也是向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[14]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,在肝纖維化早期進行干預(yù),可延緩肝纖維化進程,減輕肝纖維化程度;若得不到有效治療,肝纖維化最終會發(fā)展為肝硬化甚至肝癌,嚴(yán)重威脅人類健康。
CCl4是一種經(jīng)典的肝毒性試劑,常被用來誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型,具有重復(fù)性好、操作簡單的特點。CCl4進入肝細胞后,可直接被肝細胞膜溶解,并在肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中通過肝細胞中細胞色素P450酶代謝為活潑的自由基后,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),導(dǎo)致肝細胞損傷[15]。當(dāng)肝細胞受到損傷時,肝細胞發(fā)生變性、壞死,造成細胞內(nèi)容物溢出,存在于胞質(zhì)內(nèi)的ALT、AST被釋放進入血液,因此,血清中ALT、AST的水平可作為評估肝臟受損傷的程度[16]。本研究表明,模型組大鼠血清ALT、AST水平顯著高于正常對照組,而表兒茶素組大鼠血清ALT、AST水平顯著低于模型組,表明表兒茶素可明顯改善大鼠肝功能。病理學(xué)檢測結(jié)果也顯示,表兒茶素能夠抑制膠原纖維的生成和沉積,對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠具有明顯的保護作用。
肝纖維化一個最顯著的特征就是ECM的過度沉積,特別是α-SMA和collα1[17-18]。當(dāng)肝臟受到持續(xù)性損傷時,肝星狀細胞經(jīng)歷了一個從靜息狀態(tài)的儲脂細胞到具有高度分化和合成更多的α-SMA、collα1等ECM的肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化[19-20]。α-SMA也被認為是肝星狀細胞激活的標(biāo)志,在正常情況下,α-SMA僅在血管壁表達,發(fā)生肝纖維化時,α-SMA表達明顯增加,在假小葉及纖維縱隔內(nèi)有大量表達。通過測定肝臟組織中α-SMA、collα1蛋白的表達,可以從分子水平揭示肝纖維化的形成過程。本研究結(jié)果顯示,與正常對照組相比,模型組大鼠肝組織中α-SMA和collα1蛋白表達水平明顯升高,導(dǎo)致ECM過度沉積,形成肝纖維化;經(jīng)過表兒茶素干預(yù)后的大鼠,其肝組織中α-SMA和collα1蛋白表達水平明顯降低,表明表兒茶素可能通過抑制α-SMA和collα1的表達干預(yù)肝纖維化的進程。
綜上所述,本研究初步表明,表兒茶素對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有顯著的改善作用,其作用機制可能與抑制α-SMA和collα1有關(guān)。
安徽中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報2020年1期