趙玥琪 郝婧瑋 王穎

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法（HPLC）;儲(chǔ)存溫度;兒茶素;表兒茶素;表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯

我國(guó)是世界上最早發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用茶葉的國(guó)家，在古代，很早就有神農(nóng)嘗百草，得荼而解之的傳說(shuō)，其中荼就是茶葉[1]，而綠茶正是受大家歡迎的茶葉之一。由于產(chǎn)地、采摘季節(jié)及采摘要求、加工方式等的不同，茶葉的種類很多。從大類上可以分為白茶、綠茶、紅茶、普洱茶、烏龍茶等，其中綠茶主要是以茶樹(shù)的新葉和枝芽為原料，未經(jīng)過(guò)任何發(fā)酵工序，但經(jīng)過(guò)一系列殺青、整形、烘干等典型工藝過(guò)程制作而成的茶葉。

綠茶中含有大量的兒茶素（C）、咖啡堿以及少量的葉綠素、維生素、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分。兒茶素是類黃酮化合物[2]，它具有抗氧化[3]、抗菌消炎、抗病毒、預(yù)防癌癥[4]以及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、降血脂、降膽固醇等一系列藥理作用。

隨著研究的深入和新產(chǎn)品的不斷開(kāi)發(fā)，綠茶中的兒茶素在食品、日用化妝品、精細(xì)化工、醫(yī)藥保健等不同領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[5]。茶葉的主要功能性成分是茶多酚（TP），它是茶葉中主要抗氧化物質(zhì)，約占茶葉干質(zhì)量的15%～45%。茶多酚中大部分為黃烷醇，通常稱之為兒茶素[6]，兒茶素是一種復(fù)合化合物，也是茶樹(shù)次生代謝物的重要組成成分，使茶葉充分發(fā)揮了其保健功能。它由多種單體物質(zhì)構(gòu)成，目前已確認(rèn)的單體就有20多種。兒茶素主要的有效成分有4種，分別是表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）、表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、表兒茶素（EC）[7]。在兒茶素類物質(zhì)中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯和表兒茶素沒(méi)食子酸酯為主要有效成分，其中EGCG含量最高，占兒茶素總含量的50%左右[8]。茶葉中各有效成分的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

兒茶素是構(gòu)成綠茶功效和品質(zhì)的必不可少的化學(xué)成分，它的含量決定了綠茶品質(zhì)好壞，所以對(duì)兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯的提取進(jìn)行研究，將有助于天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)。茶葉在儲(chǔ)存期間，其內(nèi)含物質(zhì)受環(huán)境的影響，會(huì)發(fā)生各種各樣的變化，從而導(dǎo)致茶葉的感官質(zhì)量指標(biāo)降低。幾十年來(lái)，許多科學(xué)家對(duì)兒茶素的基本特性、組成及其基本的生化動(dòng)態(tài)和檢測(cè)方法等開(kāi)展了研究并獲得了不少的成就，為茶葉生化研究奠定了基礎(chǔ)[9-13]。許多研究表明，酯型兒茶素是茶葉抗癌的重要組分[14-16]，可抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化和凋亡，具有很強(qiáng)的抗癌作用，并具有很強(qiáng)的抗氧化、抗輻射、抗突變、抗高血脂、降血壓、抗血小板凝集、抗糖尿病、抗過(guò)敏和降低香煙毒害、除臭、殺菌、抑制病毒等功效，是茶多酚具有生理活性和廣闊用途的關(guān)鍵組分[17-18]。酯型兒茶素影響著茶葉飲料的品質(zhì)[19-20]。

本試驗(yàn)以綠茶為原料，利用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)其在不同儲(chǔ)存溫度條件下兒茶素的含量進(jìn)行比較研究，以期為探求綠茶儲(chǔ)存的最適宜溫度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)選用的是超市隨機(jī)購(gòu)買的綠茶。無(wú)水乙醇、色譜級(jí)甲醇（沈陽(yáng)市民聯(lián)化工有限公司）;超純水;蒸餾水;2695高效液相色譜儀、C18色譜柱[沃特世科技（上海）有限公司];GM-0.33A隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;SB-5200DTN型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技有限股份公司）;臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）;電子天平（上海天美天平儀器有限公司）;恒溫干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）;25 mL量筒;50 mL錐形瓶;25 mL燒杯;離心管;玻璃棒;電熱恒溫水浴鍋;100、1 000 μL移液槍;進(jìn)樣瓶;抽濾瓶;移液管。

1.2 試驗(yàn)方法

本試驗(yàn)利用高效液相色譜法研究不同儲(chǔ)存溫度對(duì)茶葉中兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表兒茶素含量的影響。

1.2.1 樣品溶液的制備 取2.000 0 g茶葉置于不同的溫度（-15、-5、5、15、35、55、75、95 ℃）下放置5 d，然后將其分別置于50 mL錐形瓶中，分別加入配制好的甲醇溶液 20 mL，用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，移入超聲波清洗機(jī)中，超聲提取30 min。取出錐形瓶，冷卻至室溫后，用移液槍吸取浸提液于量筒中，全部吸取后測(cè)其體積，分別進(jìn)行記錄。用移液槍分別取不同儲(chǔ)存溫度的浸提液1 mL于離心管中并標(biāo)號(hào)，放在離心機(jī)中，在4 ℃、12 000 r/min下離心20 min，用移液槍取上清液于進(jìn)樣瓶中，制得樣品。

1.2.2 色譜檢測(cè)條件 色譜柱：C18色譜柱，粒徑 5 μm，250 mm×4.6 mm;進(jìn)樣量：10 μL;流動(dòng)相：V甲醇 ∶ V水=15 ∶ 85;柱溫：30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：278 nm;檢測(cè)器：2998PDA紫外檢測(cè)器。每次檢測(cè)完成后，系統(tǒng)平衡30 min，重復(fù)進(jìn)樣，并計(jì)算峰面積。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL不同濃度的兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測(cè)定不同溶液濃度情況下兒茶素的積峰面積。以積峰面積為縱坐標(biāo)，兒茶素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL不同濃度的沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測(cè)定不同溶液濃度情況下沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的積峰面積。以積峰面積為縱坐標(biāo)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.1～3.2 mg/mL 不同濃度的表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液，以等度的條件放置在高效液相色譜儀中，測(cè)定不同溶液濃度情況下表兒茶素的積峰面積。以積峰面積為縱坐標(biāo)，表兒茶素濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 取同一份樣品試液，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為130%、0.82%、1.50%，表明儀器精密度良好。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精確稱取6份質(zhì)量為0.5 g的茶葉樣品，并按“1.2.1”節(jié)中的方法制備供試品溶液，取10 μL進(jìn)樣，測(cè)得兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素3種單體的平均含量分別為0.56%、2.82%、2.03%，RSD分別為1.3%、1.4%、1.6%，說(shuō)明這種操作方法重復(fù)性良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品溶液配制成濃度為對(duì)照品溶液80%、100%、120%（分別為低、中、高濃度）的溶液，分別在0、6、12、18、24 h進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，兒茶素低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.2%、1.3%、1.3%，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、1.4%，表兒茶素低、中、高3種濃度峰面積RSD分別為1.3%、1.8%、1.5%，表明樣品溶液放置24 h穩(wěn)定，能夠滿足測(cè)定要求。

1.2.7 加樣回收率試驗(yàn) 準(zhǔn)備制備已知含量的樣品適量，精確稱量后，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品適量，按“125”節(jié)溶液的制備方法，制備加樣供試品溶液，分別進(jìn)樣6次，觀察3種單品（兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素）的峰面積，計(jì)算RSD及平均回收率，其平均回收率分別為99.17%、99.25%、99.22%，RSD分別為1.08%、1.22%、0.78%。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以積峰面積為縱坐標(biāo)，兒茶素含量為橫坐標(biāo)，二者的線性回歸方程為y=6.6×106x-28 835.8，相關(guān)系數(shù)r=1，說(shuō)明兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品在0.1～3.2 mg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與兒茶素含量呈良好的線性關(guān)系（圖2）。

2.2 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以積峰面積為縱坐標(biāo)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量為橫坐標(biāo)，二者的線性回歸方程為y=1.3×107x-746 680.9，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9，說(shuō)明表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品在0.1～3.2 mg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量呈良好的線性關(guān)系（圖3）。

2.3 表兒茶素的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

以積峰面積為縱坐標(biāo)，表兒茶素含量為橫坐標(biāo)，二者的線性回歸方程為y=4.0×106x+166 618.3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，說(shuō)明表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品在0.1～3.2 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與表兒茶素含量呈良好的線性關(guān)系（圖4）。

2.4 儲(chǔ)存溫度對(duì)茶葉中兒茶素含量的影響

由圖5可知，儲(chǔ)存溫度為5 ℃時(shí)，兒茶素的含量最多，為0.012 4 mg/g。隨著溫度的升高或降低，兒茶素的含量均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。從5 ℃到 -15 ℃，兒茶素的含量從0.012 4 mg/g降為 0.006 7 mg/g;存儲(chǔ)溫度從5 ℃到15 ℃，兒茶素的含量從0.012 4 mg/g急劇下降為0.002 5 mg/g;從15 ℃到95 ℃，兒茶素的含量下降趨勢(shì)平緩，95 ℃時(shí)兒茶素含量為0.001 8 mg/g。

2.5 儲(chǔ)存溫度對(duì)茶葉中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量的影響

由圖6可知，儲(chǔ)存溫度在5 ℃時(shí)，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量最多，為0.805 0 mg/g。隨著溫度的升高或降低，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。從5 ℃到 -15 ℃，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量從0805 0 mg/g降為0.625 6 mg/g， 從5 ℃到15 ℃，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量從0.805 0 mg/g急劇下降為 0.215 7 mg/g;從15 ℃到95 ℃，表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯的含量下降趨勢(shì)平緩，95 ℃時(shí)含量為 0.147 1 mg/g。

2.6 儲(chǔ)存溫度對(duì)茶葉中表兒茶素含量的影響

由圖7可知，儲(chǔ)存溫度為5 ℃時(shí)，表兒茶素含量最高，為0.154 7 mg/g。隨著溫度的升高或降低，表兒茶素的含量均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。從5 ℃到 -15 ℃，表兒茶素的含量從0.154 7 mg/g降為 0.129 6 mg/g;從5 ℃到15 ℃，表兒茶素的含量從0.154 7 mg/g急劇下降為0.041 1 mg/g;從15 ℃到95 ℃，表兒茶素的含量下降趨勢(shì)平緩，95 ℃時(shí)含量為 0.026 6 mg/g。

3 討論與結(jié)論

儲(chǔ)存溫度從-15 ℃到95 ℃，兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表兒茶素的含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中，在5 ℃儲(chǔ)存溫度下含量最高，95 ℃下含量最低。本研究表明，隨著儲(chǔ)存溫度的升高，可導(dǎo)致其濃度和含量的差異。

儲(chǔ)存溫度對(duì)兒茶素提取率的影響如下。（1）儲(chǔ)存溫度升高可以加快傳質(zhì)過(guò)程，有利于有效成分的溶出，短時(shí)間內(nèi)即可達(dá)到固液均衡，從而提高兒茶素的浸提率[21-22];（2）儲(chǔ)存溫度的升高會(huì)加速兒茶素的氧化，使其有效成分含量降低，進(jìn)而降低其產(chǎn)率[23]。由此可見(jiàn)，兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表兒茶素的含量在其他條件相同的情況下，儲(chǔ)存溫度為5 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著儲(chǔ)存溫度的增加逐漸降低，在儲(chǔ)存溫度為95 ℃時(shí)達(dá)到最小值。在日常的茶葉儲(chǔ)存過(guò)程中，應(yīng)避免溫度過(guò)高或過(guò)低，以免導(dǎo)致茶葉中的有效成分含量降低。將茶葉避光保存在5 ℃左右條件下，其有效成分含量最高。本試驗(yàn)中的研究方法簡(jiǎn)單并且易于操作，所用的主要藥品甲醇為常規(guī)試劑，成本偏低，而且對(duì)環(huán)境污染較少，兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯以及表兒茶素的提取率也相對(duì)較高，表明本試驗(yàn)中工藝方法有較高的市場(chǎng)應(yīng)用前景和參考價(jià)值。

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