趙勇超 張通 王兆琛 劉春潔 張文廣 張家新

摘要 [目的]探討p66Shc對綿羊早期胚胎發(fā)育的影響。[方法]以受精后28 h為節(jié)點(diǎn)，將早期胚胎分為早卵裂胚胎和晚卵裂胚胎，觀察不同時期卵裂胚胎的進(jìn)一步發(fā)育情況，同時通過實(shí)時熒光定量PCR檢測不同來源的4-8細(xì)胞階段胚胎中p66Shc基因的表達(dá)水平;利用siRNA分子干擾技術(shù)將特異性siRNA分子通過顯微注射到綿羊合子細(xì)胞質(zhì)中，以敲減早期胚胎p66Shc基因;通過免疫熒光技術(shù)檢測p66Shc基因?qū)d羊早期胚胎發(fā)育過程中活性氧（ROS）和氧化應(yīng)激標(biāo)記物（8-OHdG）表達(dá)的影響。[結(jié)果]早卵裂胚胎的囊胚發(fā)育率顯著高于晚卵裂胚胎（P<0.05）;晚卵裂胚胎中p66Shc mRNA表達(dá)水平顯著高于早卵裂胚胎（P<0.05）;將綿羊早期胚胎中的p66Shc基因敲減后，與對照組相比，其胚胎內(nèi)p66Shc mRNA水平、 p66Shc蛋白水平顯著降低，ROS和8-OHdG水平顯著低于對照組（P<0.05）;基因敲減后桑椹胚發(fā)育率顯著升高（P<0.05）。[結(jié)論]低水平的p66shc可以提高綿羊早期胚胎對氧化應(yīng)激的抵抗力，并進(jìn)一步提高其發(fā)育能力。

關(guān)鍵詞 綿羊;p66Shc;早期胚胎;卵裂;氧化應(yīng)激

中圖分類號 S 826? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0108-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Effects of p66Shc on the Early Embryo Development of Sheep

ZHAO Yong-chao ZHANG Tong WANG Zhao-chen1 et al （1.College of Animal Science，Inner Mongolia Agricultural University/Inner Mongolia Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction，Hohhot，Inner Mongolia 010018; 2.College of Medicine，Shanxi Datong University，Datong，Shanxi 037009）

Abstract [Objective]To explore the effects of p66Shc on early embryo development of sheep.[Method] The early embryos were divided into early cleavage （EC） embryo and late cleavage（LC） embryo at 28 h after fertilization （28hpi）.The further development of cleavage embryos at different stages were observed.At the same time，the expression level of p66Shc gene in 4-8 cell stage early embryos from different sources was detected by real-time quantitative PCR.Using siRNA molecular interference technology，specific siRNA molecules were microinjected into the cytoplasm of sheep zygotes，so as to knock down p66Shc gene of early embryos.The effects of p66Shc gene on reactive oxygen species （ROS） and oxidative stress marker （8-OHDG） during the early embryo development process of sheep were investigated by using immunofluorescence? technique.[Result]The blastocyst development rate of EC embryos was significantly higher than that of LC embryos （P<0.05）.The expression level of p66Shc mRNA in LC embryos was significantly higher than that in EC embryos （P<0.05）.After knocking down p66Shc interference，p66Shc mRNA and protein levels in early sheep embryos were significantly decreased than those in control group（P<0.05），the expression levels of ROS and 8-OHdG in early sheep embryos were lower significantly than those in control group （P<0.05）.Moreover，morula development rate? was significantly increased （P<0.05）after knocking down p66Shc gene.[Conclusion]Low level of p66Shc could improve the resistance of early sheep embryos to oxidative stress and further improve their developmental ability.

Key words Sheep;p66Shc;Early embryo;Cleavage;Oxidative stress

基金項(xiàng)目

內(nèi)蒙古自治區(qū)科技重大專項(xiàng)（2020ZD0003）。

作者簡介 趙勇超（1995—），女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士研究生，研究方向：家畜繁殖生物學(xué)與繁殖技術(shù)。*通信作者，教授，博士，博士生導(dǎo)師，從事家畜繁殖生物學(xué)與繁殖技術(shù)研究。

收稿日期 2021-01-19

近年來，綿羊體外胚胎生產(chǎn)（IVEP）被廣泛關(guān)注，利用IVEP體系可以采集有生殖障礙、性成熟前、妊娠期、哺乳期及屠宰后的母羊卵巢卵母細(xì)胞用于生產(chǎn)，可以大幅提高優(yōu)秀種質(zhì)資源利用率、縮短世代間隔，對于綿羊的品種改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值。IVEP是包括多個步驟方法的操作體系，其中包括體外成熟（IVM）、體外受精（IVF）、受精卵體外培養(yǎng)（IVC），其中受精卵體外培養(yǎng)是對胚胎質(zhì)量影響最大的階段[1]。體外培養(yǎng)的胚胎容易受到環(huán)境氧化應(yīng)激的影響[2]。在對牛早期胚胎的研究中發(fā)現(xiàn)，合子首次卵裂發(fā)生在受精后20～48 h，13.5%的早期胚胎發(fā)育停滯在2-4細(xì)胞期。然而，在受精28 h前卵裂的胚胎的發(fā)育停滯僅為0.6%，但受精28 h后卵裂的胚胎發(fā)育停滯率高達(dá)14%[3]。體外培養(yǎng)過程中胚胎過度產(chǎn)生ROS會超越胚胎抗氧化防御能力，觸發(fā)細(xì)胞凋亡、壞死或永久性細(xì) 胞周期阻滯[4-5]。人體外胚胎培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中第1天的ROS水平升高與胚胎發(fā)育延遲，囊胚破碎率及形態(tài)發(fā)育異常率升高相關(guān)，第3天在培養(yǎng)基中產(chǎn)生的ROS是囊胚發(fā)育的重要生化指標(biāo)[6-7]。因此，體外胚胎發(fā)育能力低于體內(nèi)胚胎很大程度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平異常升高有關(guān)[3]。利用低氧環(huán)境培養(yǎng)或補(bǔ)充抗氧化劑[8-9]的方式可以減少細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，從而改善囊胚發(fā)育能力。

p66Shc是銜接蛋白Shc1家族的成員，合子發(fā)育至囊胚階段均有表達(dá)[10]，在生長因子受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ROS的產(chǎn)生和氧化磷酸化代謝中發(fā)揮作用[11]。對牛胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，高氧環(huán)境會導(dǎo)致p66Shc的表達(dá)水平顯著增加[12]，而低氧環(huán)境或胚胎培養(yǎng)基中補(bǔ)充過氧化氫酶后p66Shc的表達(dá)水平顯著降低[ 13-14]。降低未成熟牛卵母細(xì)胞的p66Shc水平可以顯著降低其受精后的胚胎發(fā)育停滯的發(fā)生率[ 13]。這些結(jié)果表明p66Shc參與介導(dǎo)早期胚胎抗氧化應(yīng)激，并影響了其進(jìn)一步的發(fā)育。

為了確定p66Shc對綿羊早期胚胎發(fā)育的影響，筆者通過檢測綿羊早期胚胎的卵裂模式及不同卵裂模式下p66Shc基因表達(dá)和線粒體活性，在此基礎(chǔ)上研究p66Shc基因干擾后對綿羊胚胎細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、DNA氧化應(yīng)激損傷和胚胎發(fā)育潛能的影響，旨在為提高綿羊早期胚胎體外發(fā)育能力提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

TCM-199、DPBS、青鏈霉素合劑（PS）均購自 Gibco 公司;促卵泡生成素（FSH）、促黃體生成素（LH）購自 Bioniche 公司;雌二醇（E2）、胎牛血清（FBS）、 牛血清白蛋白（BSA）、透明質(zhì)酸酶、聚乙烯醇（PVA）、半胱胺均購自 Sigma 公司;siRNA購自上海Gene Pharma公司;qRT-PCR引物購自上海生工公司;RNeasy Mini kit （Qiagen）微量樣品總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司;Reactive Oxygen Species Assay Kit購自Solarbio公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購自TaKaRa公司;p66Shc兔源一抗、8-OHdG兔源一抗和Alexa 488標(biāo)記的山羊抗兔的二抗均購自Proteintech公司。

1.2 卵母細(xì)胞收集和體外成熟

將屠宰場收集的綿羊離體卵巢保存在37 ℃的滅菌生理鹽水（含雙抗）的保溫瓶中，2～3 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢用含青鏈霉素的滅菌生理鹽水沖洗3次，用10 mL注射器抽取1～2 mL預(yù)熱的采卵液（DPBS+1 mg/mL BSA+6 IU/mL肝素鈉+1%PS），從卵巢表面抽取直徑3～6 mm的卵泡內(nèi)容物，挑選出胞質(zhì)均勻且外周包裹有 3 層以上卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs），將 COCs 用采卵液和成熟液[TCM-199+10% （V/V） FBS+10 μg/mL FSH +10 μg/mL LH+1? μg/mL E2+0.1 mmol/L CYS+1% PS]分別清洗2次后放入成熟液滴中，在38.6 ℃、5% CO 95%空氣、飽和濕度條件下體外成熟培養(yǎng)24 h。

1.3 體外受精和體外培養(yǎng)

將綿羊細(xì)管冷凍精液在39 ℃水浴解凍約1 min，將解凍精液在1.5 mL的EP管中混合均勻，取300 μL輕輕加入裝有已平衡2 h以上700 μL受精液（mSOFaa液+ 2%發(fā)情綿羊血清 + 6 IU/mL肝素鈉）的試管底部，置于培養(yǎng)箱中孵育上游40 min。然后，將中間層的精液轉(zhuǎn)移到1.5 mL EP管中，在1 300 r/min轉(zhuǎn)速下4 min離心洗滌2次，棄掉上清液，然后加入適量受精液輕輕吹打混勻，調(diào)整精子密度約2×106個/mL后用于受精。在精子孵育上游的同時，使用0.1%透明質(zhì)酸酶將成熟的卵母細(xì)胞外周的卵丘顆粒細(xì)胞部分吹打去除，并轉(zhuǎn)移到受精液培養(yǎng)滴中。將混合均勻的精子懸液加入受精液培養(yǎng)滴內(nèi)與卵母細(xì)胞共同培養(yǎng)20 h。

將假定的受精卵用移液器反復(fù)吹吸，去除黏附在透明帶外周的顆粒細(xì)胞。將受精卵用發(fā)育液（mSOFaa液+BSA 3 mg/mL）洗滌3次后，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，部分受精卵用于顯微注射，部分受精卵轉(zhuǎn)移到四孔培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：5%CO2、5%O2、90%N2、38.6 ℃飽和濕度。受精后48 h統(tǒng)計(jì)卵裂率，受精后7 d統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.4 早期胚胎內(nèi)源性p66Shc敲減

為了減弱內(nèi)源性p66Shc mRNA，將p66Shc的siRNA顯微注射到綿羊合子階段的細(xì)胞質(zhì)中。靶向p66Shc特異的CH2結(jié)構(gòu)域的siRNA序列如下：正向序列為5′-GCAGUCAUGCUGGACUCAGTT-3′，反向序列為5′-CUGAGUCCAGCAUGACUGCTT-3′。在含有7.5 μg/mL CB（細(xì)胞松弛素B）的T2（2% FBS的TCM-199）培養(yǎng)液中借助顯微注射系統(tǒng)將大約10 pL siRNA溶液（25 μmol/L）顯微注射到合子階段的胚胎細(xì)胞質(zhì)中，同時未注射組、注射溶劑組（陰性對照組）作為對照，顯微注射結(jié)束后各處理組的受精卵用發(fā)育液洗滌3次后，轉(zhuǎn)移到Nunc四孔培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件如下：5% CO2、5% O2、90% N2、38.6 ℃飽和濕度。

1.5 qRT-PCR

為了檢測綿羊胚胎中p66Shc mRNA的表達(dá)豐度，受精后48 h收集4～8細(xì)胞階段的綿羊胚胎。按照RNeasy Mini kit微量樣品總RNA提取試劑盒說明書提取胚胎的總RNA并合成cDNA，并將所得cDNA置于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank查找綿羊的p66Shc序列和β-actin序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，以SYBR為熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算p66Shc的相對表達(dá)量。

1.6 免疫熒光分析

收集不同處理組的胚胎，將胚胎用500 nmol/L MitoTracker Red CMX Ros在室溫下染色30 min。然后，用4%多聚甲醛將胚胎固定15 min，并用0.1%Triton X-100透化30 min。將透化之后的胚胎在5% BSA的PBS中室溫下封閉1 h。用p66Shc特異性一抗（1∶100）染色，4 ℃下孵育過夜。將胚胎用含有0.1% PVA的PBS洗滌3次后，在室溫下將胚胎用Alexa Fluor 488山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（1∶200）孵育1 h。用含有0.1% PVA的PBS洗滌3次后，用1 μg/ mL DAPI溶液將胚胎復(fù)染10 min。將染色的胚胎用激光共聚焦顯微鏡檢測p66Shc（Ex 578 nm，Em 598 nm），MitoTracker Red（Ex 578 nm，Em 598 nm）和DAPI（Ex 359 nm，Em 461 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用FV10-ASW 4.2 Viewer軟件進(jìn)行圖像分析。

1.7 ROS 檢測

收集不同處理組的胚胎，使用終濃度為10 μmol/mL的熒光染料DCFH-DA孵育綿羊胚胎30 min，使用激光共聚焦顯微鏡（Ex 480nm， Em 525 nm）檢測熒光信號，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用FV10-ASW 4.2 Viewer軟件進(jìn)行圖像分析。

1.8 8-OHdG檢測

羥脫氧鳥苷（8-OHdG）是敏感的DNA氧化應(yīng)激損害標(biāo)志物，收集不同處理組的胚胎，使用4%的多聚甲醛室溫固定胚胎20 min，將固定的胚胎在0.1% Triton X-100的PBS中透化20 min，隨后在含5%山羊血清的PBS中室溫封閉1 h，將胚胎在8-OHdG兔源一抗（1∶100）中4 ℃孵育過夜。將洗滌后的胚胎轉(zhuǎn)入二抗（Alexa Fluor標(biāo)記的山羊抗兔）孵育30 min，用1 μg/mL DAPI染色15 min。將染色的胚胎轉(zhuǎn)移到35 min的共聚焦皿中，在激光共聚焦顯微鏡檢測8-OHdG（Ex 557 nm，Em 572 nm）。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，使用FV10-ASW 4.2 Viewer軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）的ANOVA分析差異顯著性，然后進(jìn)行Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量早期胚胎的p66Shc表達(dá)

在受精后28 h統(tǒng)計(jì)胚胎的卵裂率。如圖1A所示， 早卵裂（≤28hpi，early cleavage，EC）胚胎的囊胚形成率（66.67%）顯著高于晚卵裂（>28hpi，late cleavage，LC）胚胎（22.93%，P<0.05）。qRT-PCR結(jié)果顯示，LC胚胎的p66Shc mRNA水平顯著高于EC胚胎（P<0.05）（圖1B）。因此，綿羊早期胚胎的卵裂時間直接關(guān)系到后續(xù)胚胎的發(fā)育能力，且低質(zhì)量的綿羊胚胎可能與p66Shc表達(dá)增加有關(guān)。

2.2 siRNA靶向干擾對早期胚胎p66Shc基因表達(dá)的影響

qRT-PCR和免疫熒光結(jié)果（圖2）表明，siRNA干擾組p66Shc mRNA和蛋白水平在4-8細(xì)胞階段顯著低于未注射組、注射溶劑組（P<0.05），未注射組、注射溶劑組間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.3 p66Shc基因干擾降低ROS的產(chǎn)生

利用DCFH-DA探針檢測了敲除p66Shc基因?qū)ε咛OS的積累產(chǎn)生的影響。如圖3所示，siRNA干擾組胚胎ROS的積累顯著低于未注射組、注射溶劑組（P<0.05）。然而，未注射組和注射溶劑組之間沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4 胚胎內(nèi)p66Shc 基因干擾降低氧化應(yīng)激標(biāo)記物8-OHdG的產(chǎn)生 通過免疫熒光技術(shù)檢測了干擾p66Shc基因?qū)ρ趸瘧?yīng)激標(biāo)志物8-OHdG的水平產(chǎn)生的影響。如圖4所示，顯微注射siRNA干擾組8-OHdG的熒光強(qiáng)度在4-8 細(xì)胞階段顯著低于未注射組和注射溶劑組（P<0.05），而未注射組和注射溶劑組之間沒有顯著差異（P>0.05）。2.5 胚胎內(nèi)p66Shc基因干擾提高綿羊胚胎的發(fā)育潛能

為了確定p66Shc基因干擾是否影響綿羊胚胎的發(fā)育潛能，統(tǒng)計(jì)了早期胚胎發(fā)育過程中的卵裂率、桑葚胚率和囊胚率，結(jié)果如表2所示。由表2可知，siRNA干擾組p66Shc基因后綿羊胚胎的卵裂率和囊胚率分別為63.00%和36.00%，與未注射組（分別為70.00%和34.00%）、注射溶劑組（分別為64.00%和33.45%）沒有明顯差異（P>0.05）。然而，siRNA干擾組的桑椹胚率（24.00%）顯著高于其他組（未注射組13.56%，注射溶劑組13.08%，P<0.05）。

3 討論

合子的第一次卵裂是哺乳動物胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛力的指標(biāo)。該研究結(jié)果表明早期卵裂（≤28 h）胚胎的囊胚率顯著高于晚卵裂（>28 h）胚胎，早卵裂胚胎的質(zhì)量優(yōu)于晚卵裂胚胎。這些結(jié)果表明，早卵裂胚胎比晚卵裂胚胎更有潛力發(fā)育至囊胚。近年來，有研究表明人類的早卵裂胚胎比晚卵裂胚胎囊胚率提高近30%，妊娠率提高20%以上[15-16]。因此，第一次卵裂分裂時間可以用作哺乳動物胚胎發(fā)育質(zhì)量的內(nèi)源性標(biāo)志。

該試驗(yàn)研究了早卵裂胚胎和晚卵裂胚胎p66Shc基因的表達(dá)與線粒體的分布與活性。結(jié)果表明，與早卵裂胚胎相比，晚卵裂胚胎中的p66Shc mRNA表達(dá)豐度和蛋白質(zhì)積累顯著增加，這與牛早期胚胎的研究結(jié)果相似[3]。

RNA干擾技術(shù)是研究哺乳動物卵母細(xì)胞和早期胚胎中誘導(dǎo)序列特異性基因沉默的常用試驗(yàn)方法[17]。該研究中p66Shc特異性siRNA干擾分子被顯微注射到綿羊受精卵合子階段的細(xì)胞質(zhì)中。p66Shc序列N-末端有一個額外的CH域，稱為CH2結(jié)構(gòu)域[1 18]。通過設(shè)計(jì)合成靶向綿羊p66Shc基因特異的CH2結(jié)構(gòu)域的干擾分子。結(jié)果表明，與未注射組、注射溶劑組的胚胎相比， siRNA分子誘導(dǎo)胚胎中p66Shc mRNA和蛋白質(zhì)的顯著下調(diào)。

體外胚胎發(fā)育能力之所以不如體內(nèi)胚胎，很大程度上與胚胎體外培養(yǎng)環(huán)境容易引起氧化應(yīng)激有關(guān)。正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平處于平衡狀態(tài)，而且適量ROS在多個信號通路中發(fā)揮著重要作用[19-20]。但是，當(dāng)ROS代謝失衡就會引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響胚胎的正常發(fā)育[21-22]。該研究中在綿羊合子階段顯微注射p66Shc siRNA導(dǎo)致胚胎細(xì)胞內(nèi)p66Shc的mRNA和蛋白質(zhì)水平顯著降低，而且在胚胎隨后的發(fā)育過程中，細(xì)胞的ROS水平降低，氧化應(yīng)激標(biāo)志物8-OHdG的減少。這也表明p66Shc在調(diào)節(jié)胚胎細(xì)胞內(nèi)ROS水平發(fā)揮著重要作用，目前普遍認(rèn)為p66Shc在介導(dǎo)線粒體ROS產(chǎn)生過程中起了關(guān)鍵作用[23]。

在胚胎體外發(fā)育過程中，發(fā)育阻滯的發(fā)生是影響胚胎發(fā)育能力的主要因素，不同動物胚胎的阻滯期也不同，綿羊發(fā)生于8-16細(xì)胞期[24]。該研究中顯微注射p66Shc RNAi干擾分子組的桑椹胚率顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組，這表明早期綿羊胚胎內(nèi)源p66Shc基因敲減后，胚胎通過阻滯期，并進(jìn)一步發(fā)育為桑椹胚的能力提高。Betts等[14]通過向牛合子顯微注射siRNA分子干擾p66Shc基因表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)停滯在2-4細(xì)胞期胚胎比率明顯降低。這表明早期胚胎內(nèi)低水平的p66Shc有利于胚胎通過發(fā)育阻滯期，提高其進(jìn)一步發(fā)育的能力。這種作用可能是低水平的p66Shc引起了胚胎抗氧化能力的提高，但本試驗(yàn)中RNAi干擾組的囊胚率與其他組之間沒有顯著差異。這可能是由于合子時期胞質(zhì)顯微注射干擾分子后改變了囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中某些基因的轉(zhuǎn)錄[21]，從而影響了囊腔的形成，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

p66Shc參與了綿羊胚胎細(xì)胞內(nèi)高水平ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和氧化損傷，進(jìn)而影響了胚胎體外發(fā)育潛力。

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