王 磊，常繼濤，于 力

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 牛羊傳染病研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，黑龍江哈爾濱150069)

牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus，BRSV)是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要病原之一，主要引起2 月齡～6 月齡犢牛的細(xì)支氣管炎和間質(zhì)性肺炎[1]。BRSV 呈世界性分布，廣泛分布于美國、日本、巴西[2]、意大利[3]等許多國家。在國內(nèi)已有 BRSV 被鑒定的報(bào)道[4-5]，表明我國存在BRSV 感染。目前，我國尚無BRSV 疫苗的使用，因此建立高通量的間接ELISA 抗體檢測方法開展BRSV 感染的血清流行病學(xué)調(diào)查，這將對(duì)制訂該病的防控策略具有重要意義。

BRSV 是一種有囊膜、基因組不分節(jié)段的負(fù)股RNA 病毒，是副粘病毒科、肺病毒亞科、肺病毒屬成員。BRSV 的基因組全長約為15 000 nt，編碼9種結(jié)構(gòu)蛋白(G、F、SH、M、M2-1、M2-2、P、L 和N)、2 種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1 和 NS2)[6]。其中F 蛋白是BRSV 的主要保護(hù)性中和抗原[7]，其結(jié)構(gòu)與其它副黏病毒的F 蛋白相似，由574 個(gè)氨基酸組成，具有吸附細(xì)胞以及形成合胞體的功能，最初合成時(shí)為無活性的F0 前體，在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)內(nèi)切酶激活產(chǎn)生兩個(gè)亞基F1 和F2[8]。融合前的F 蛋白呈亞穩(wěn)定狀態(tài)、具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)中和抗體的能力，經(jīng)過結(jié)構(gòu)重構(gòu)能夠自發(fā)地形成融合后狀態(tài)，因而喪失了許多優(yōu)勢中和表位[9-10]。因此，只有融合前的F 蛋白含F(xiàn) 蛋白的優(yōu)勢抗原表位，而融合后的F 蛋白僅含有部分抗原表位，即融合前的F 蛋白包含融合后F 蛋白的抗原表位[11]。在人呼吸道合胞體病毒(HRSV)的研究過程中已發(fā)現(xiàn)，自然感染人血清中的中和抗體絕大部分是針對(duì)融合前F 蛋白的[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)自然感染BRSV 的牛血清檢測結(jié)果顯示，其中和抗體也是主要針對(duì)融合前F 蛋白(常繼濤等，未發(fā)表資料)。此外，本實(shí)驗(yàn)室前期基于BRSV 和HRSV 的高度同源性以及現(xiàn)有HRSV F 蛋白的研究結(jié)果，參考HRSV F 蛋白的結(jié)構(gòu)，分別從融合前狀態(tài)的穩(wěn)定化、三聚體的形成、分泌表達(dá)、蛋白的穩(wěn)定性以及表達(dá)量等方面，對(duì)BRSV LJX31 株F 蛋白進(jìn)行了多個(gè)位點(diǎn)的修飾和結(jié)構(gòu)優(yōu)化。修飾的內(nèi)容主要包括：增加二硫鍵、改變疏水性填充、更改信號(hào)肽、添加三聚體結(jié)構(gòu)、去除融合肽以及降低融合前構(gòu)象的能量，最終實(shí)現(xiàn)F 蛋白融合前的穩(wěn)定性改造。并將優(yōu)化和修飾的融合前F 蛋白的基因克隆至穿梭載體pShuttle-CMV 中，構(gòu)建重組穿梭載體。將穿梭載體線性化后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至含有腺病毒骨架載體AdEasy-1-BJ5183E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)抗生素篩選，構(gòu)建了表達(dá)融合前F 蛋白的重組腺病毒，最終實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的BRSV 融合前F 蛋白的體外表達(dá)(常繼濤等，未發(fā)表資料)。

本研究利用重組腺病毒表達(dá)的融合前F 蛋白作為抗原建立了BRSV 抗體的間接ELISA 檢測方法，理論上可以檢測自然感染動(dòng)物的血清抗體、全病毒滅活疫苗免疫動(dòng)物的血清抗體以及融合前F 蛋白亞單位疫苗免疫動(dòng)物的血清抗體，為BRSV 感染的血清學(xué)調(diào)查以及疫苗免疫評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 血清 阿卡斑病毒(AKAV)、牛輪狀病毒(BRV)、藍(lán)舌病毒(BTV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛副流感病毒 3 型(BPIV3)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)、牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存；195 份臨床牛血清樣品于2012年～2017 年采集自內(nèi)蒙古(20 份)、吉林(11 份)、黑龍江(17 份)、新疆(110 份)、遼寧(7 份)、寧夏(24份)、山東(6 份)等地區(qū)，其中包含用于確定臨界值的40 份BRSV 抗體陰性血清，分別來自內(nèi)蒙古(5份)、吉林(4 份)、新疆(22 份)、遼寧(4 份)、寧夏(5份)。

1.2 主要試劑 羊抗牛IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP購自Sigma 公司；TMB 顯色液購自碧云天生物技術(shù)公司；抗F 蛋白的單克隆抗體(MAb)、HEK293 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；表達(dá)融合前F 蛋白的重組腺病毒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

1.3 融合前F 蛋白的純化與鑒定 將表達(dá)融合前F蛋白的重組腺病毒接種HEK293 細(xì)胞，37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)3 d、細(xì)胞病變?yōu)?00 %時(shí)收集上清用于蛋白純化。將收集的36 mL 上清液與4 mL 結(jié)合緩沖液和5 mL 鎳混合，置于冰上搖1 h～2 h，而后經(jīng)洗脫柱過濾后用10 mL 10 mmol/L 咪唑洗滌3 次，用1 mL 250 mmol/L 咪唑洗脫10 次，收集每管流出液即純化的融合前F 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 分析。以F 蛋白的MAb (1∶100)為一抗，以羊抗鼠IgG-HRP(1∶1 000)為二抗，進(jìn)行融合前F 蛋白的western blot鑒定。同時(shí)將純化后的蛋白進(jìn)行薄層掃描分析該蛋白純度。

1.4 ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過方陣滴定法確定抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度。采用0.05 mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液作為包被液，將提純的融合前F 蛋白 2 倍倍比稀釋(4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L、0.25 mg/L)后以 100 μL/ 孔橫向加入酶標(biāo)板，4 ℃包被過夜。將BRSV 抗體陽性和陰性牛血清分別以1∶100、1∶200、1∶400、1∶800 倍比稀釋后進(jìn)行方陣試驗(yàn)。之后用酶標(biāo)儀測定BRSV 抗體陽性和陰性血清的OD450nm值，以P/N 值(陽性血清OD450nm/ 陰性血清OD450nm)最大時(shí)的反應(yīng)條件為最佳工作條件。同時(shí)對(duì)封閉液(1 %明膠、3 %明膠、5 %明膠、1 % BSA和 10 % BSA)及 37 ℃作用時(shí)間(30 min、45 min、60 min 和 75 min)、血清作用時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min 和 90 min)、羊抗鼠 IgG-HRP 稀釋倍數(shù)(1∶5 000、1∶8 000、1∶10 000 和 1∶12 000)及作用時(shí)間(30 min、45 min、60 min、75 min 和 90 min)、底物顯色時(shí)間(5 min、10 min 和15 min)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 臨界值的確定 按照以上優(yōu)化的反應(yīng)條件，檢測40 份BRSV 抗體陰性牛血清的OD450nm值，計(jì)算平均數(shù)()和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原則，樣本的OD450nm值≥+3SD 時(shí)，可在99.9 %的準(zhǔn)確率水平上判為陽性。

1.6 特異性試驗(yàn) 用建立的間接ELISA 方法分別檢測AKAV、RV、BTV、FMDV、BPIV3、BVDV、IBRV 的陽性血清，同時(shí)以BRSV 陰陽性血清為對(duì)照，檢測該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將BRSV 陽性血清2 倍倍比稀釋(1∶200～1∶12 800)后，分別利用已建立的間接 ELISA方法和病毒中和試驗(yàn)[10]對(duì)其進(jìn)行檢測，評(píng)估本研究建立的ELISA 方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)：在已經(jīng)確定的反應(yīng)條件下，對(duì)6 份不同抗體水平的BRSV 陽性血清進(jìn)行檢測，每份血清樣品重復(fù)4 孔，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。批間重復(fù)試驗(yàn)：將融合前F 蛋白不同批次包被的ELISA 板，對(duì)上述6 份BRSV 陽性血清進(jìn)行檢測。試驗(yàn)重復(fù)4 次，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.9 符合率試驗(yàn) 隨機(jī)選取臨床采集的195 份牛血清樣品中的143 份，同時(shí)采用建立的間接ELISA 方法和病毒中和試驗(yàn)[13]檢測，比較二者的檢測結(jié)果，計(jì)算二者的符合率。

1.10 臨床樣品檢測 利用本研究建立的間接ELISA 方法對(duì)采集于不同地區(qū)的195 份臨床牛血清樣品進(jìn)行檢測，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初步分析各地區(qū)BRSV 的感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 融合前F 蛋白的純化與鑒定 用親和層析方法純化重組腺病毒在HEK293 細(xì)胞中表達(dá)的融合前F 蛋白。對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。結(jié)果顯示，純化蛋白的分子量為58 ku，與預(yù)期相符(圖1A)；薄層掃描分析顯示，其純度可達(dá)80 %；western blot 結(jié)果顯示，純化的融合前F 蛋白可以與相應(yīng)的F 蛋白MAb 發(fā)生特異性反應(yīng)(圖1B)。表明純化的融合前F 蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.2 間接ELISA 最佳反應(yīng)條件的確定 采用方陣滴定法優(yōu)化ELISA 反應(yīng)條件，以P/N 值最大者為最佳條件，優(yōu)化結(jié)果見表1。

表1 間接ELISA 檢測方法反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect ELISA

圖1 純化的融合前F 蛋白SDS-PAGE 檢測(A)和western blot 鑒定(B)Fig.1 SDS-PAGE (A) and western blot (B) analysis of purified prefusion-F protein

2.3 臨界值的確定 將40 份BRSV 抗體陰性血清，按照最優(yōu)的間接ELISA 條件進(jìn)行檢測，將測得的OD450nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，檢測數(shù)據(jù)的為0.057，SD 為0.049，臨界值為+3SD=0.204。因此判定，OD450nm≥0.204 為陽性，OD450nm＜0.204 判為陰性。

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用優(yōu)化后的間接ELISA 方法， 檢測 AKAV、 BRV、 BTV、 FMDV、 BPIV、BVDV、IBRV 的陽性血清，結(jié)果均為陰性(圖2)，而且BRSV 陰陽性血清對(duì)照均成立，表明本研究建立的間接ELISA 方法具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of specificity test

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將BRSV 陽性血清做1∶200～1∶12 800 倍稀釋，用本研究建立的ELISA 方法和病毒中和試驗(yàn)分別檢測。結(jié)果顯示，ELISA 方法檢測的血清稀釋度為1∶6 400，病毒中和試驗(yàn)檢測的血清稀釋度為1∶3 200 (表2)，表明本研究建立的間接ELISA 方法的敏感性較高且略高于病毒中和試驗(yàn)。

表2 間接ELISA 方法的敏感性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The sensitivity test of the indirect ELISA

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 將6 份不同抗體水平的BRSV 陽性血清進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)最大為6.80 %，最小為2.65 % (表3)；將該6 份血清進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，批間變異系數(shù)最大為8.80 %，最小為3.79 % (表3)。表明該方法具有較好的重復(fù)性。

表3 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Intra-batch and inter-batch duplicability test

2.7 符合率試驗(yàn)結(jié)果 將195 份采自不同地區(qū)的牛血清樣品中的143 份進(jìn)行間接ELISA 檢測，并與病毒中和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，間接ELISA方法檢出87 份BRSV 抗體陽性樣品，病毒中和試驗(yàn)檢出80 份BRSV 抗體陽性樣品。間接ELISA 和病毒中和試驗(yàn)的陽性樣品符合率為95.0 % (76/80)，陰性樣品符合率為82.5 % (52/63)，總符合率為89.5 %(128/143)。表明本研究建立的間接ELISA 方法敏感性高于病毒中和試驗(yàn)，臨床應(yīng)用中可提高檢測的準(zhǔn)確性，避免漏檢。

2.8 間接ELISA 抗體檢測方法的應(yīng)用 應(yīng)用本研究建立的間接ELISA 方法對(duì)采自內(nèi)蒙古、遼寧、黑龍江等不同地區(qū)的195 份牛血清進(jìn)行檢測，檢出BRSV 抗體陽性樣品 119 份，陽性率為 61.0 %(119/195)。不同地區(qū)的血清樣品陽性率差異較大，黑龍江某縣(17 份)的血清抗體陽性率最高(100 %)；遼寧某地區(qū)(7 份)的血清陽性率最低(14.3 %) (表4)。雖然不同地區(qū)的血清樣品抗體陽性率差異較大，但每個(gè)地區(qū)均能夠檢測出BRSV 抗體陽性的樣品，表明BRSV 在我國的流行十分廣泛。

表4 臨床牛血清樣品檢測結(jié)果Table 4 The detection of clinical bovine serum samples by the ELISA

3 討 論

BRSV 感染在世界范圍內(nèi)廣泛存在，我國尚缺乏對(duì)該病全面的流行病學(xué)調(diào)查研究。血清抗體檢測是疫病流行病學(xué)調(diào)查研究的重要手段，而目前國內(nèi)尚無商品化BRSV 抗體檢測試劑盒。本研究采用BRSV 融合前F 蛋白作為包被抗原，建立了檢測該病毒抗體的間接ELISA 方法，并對(duì)各反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，提高了該方法的敏感性和重復(fù)性。人工引入信號(hào)肽使得表達(dá)的F 蛋白完全分泌至細(xì)胞上清，并采用鎳柱親和層析直接對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行蛋白純化，最大程度地提升了F 蛋白的純度；同時(shí)參照IDEXX 試劑盒的操作方法，在檢測過程中設(shè)置了無抗原對(duì)照孔，有效減少了非特異性反應(yīng)，降低了背景值。蛋白純度的提升和抗原陰性孔的設(shè)置，大幅度增強(qiáng)了該方法的特異性。此外，該檢測方法與病毒中和試驗(yàn)的總體符合率為89.5 %，表明該檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性。這些研究為今后開發(fā)BRSV ELISA 抗體檢測試劑盒奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

融合前BRSV F 蛋白包含F(xiàn) 蛋白大部分優(yōu)勢抗原表位，而融合后的F 蛋白則喪失大部分優(yōu)勢表位。因此本研究以融合前F 蛋白為抗原建立的間接ELISA 方法，理論上可以檢測針對(duì)融合前F 蛋白的免疫抗體、融合后F 蛋白的免疫抗體、自然感染動(dòng)物的血清抗體以及滅活疫苗的免疫抗體。在我國尚無BRSV 疫苗應(yīng)用的情況下，對(duì)融合前F 蛋白抗體的血清學(xué)檢測基本能夠反應(yīng)BRSV 在我國的感染和流行情況。因此，本研究建立的基于BRSV 融合前F 蛋白的間接ELISA 方法可以用于該病毒的大規(guī)模血清流行病學(xué)調(diào)查。

采用該方法對(duì)黑龍江、遼寧等7 個(gè)地區(qū)的195份牛血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示不同地區(qū)均能檢測到BRSV 抗體陽性血清樣品，但不同地區(qū)抗體陽性率差異較大，抗體總陽性率達(dá)61 %。此外，王紅等利用純化的BRSV HJ 株重組N 蛋白作為包被抗原，建立了檢測BRSV 抗體的間接ELISA 方法，并對(duì)黑龍江省4 個(gè)地區(qū)(牡丹江、佳木斯、鶴崗和大慶)牛場的600 份牛血清進(jìn)行了檢測，抗體陽性率為27.33%[13]；童欽等采用病毒中和試驗(yàn)對(duì)采自新疆的803 份牛血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，病毒陽性率為54.17 %。這些研究結(jié)果表明BRSV 在我國的流行比較普遍。

上述結(jié)果表明本研究建立的間接ELISA 方法可以用于牛群中BRSV 抗體的檢測，為BRSV 的血清流行病學(xué)調(diào)查提供了可靠的技術(shù)手段。