郭凱文，楊翠翠，張?zhí)m

首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥學(xué)部，北京市神經(jīng)藥物工程技術(shù)研究中心，北京腦重大疾病研究院，神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京市100053

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的特征性病理改變神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles,NFTs)是導(dǎo)致神經(jīng)元退變的主要原因，可作為腦老化的標(biāo)志，與AD 的認(rèn)知功能障礙程度呈正相關(guān)[1]。微管相關(guān)蛋白tau能夠產(chǎn)生許多異常翻譯后修飾并聚集形成配對(duì)螺旋絲，NFTs 是配對(duì)螺旋絲進(jìn)一步沉積形成的。其中，磷酸化和截?cái)嗍莟au蛋白翻譯后修飾的主要形式，并且與AD 的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[2-5]。鈣蛋白酶(calpain)是一種細(xì)胞內(nèi)蛋白酶家族，通過(guò)專(zhuān)一性蛋白水解酶作用發(fā)揮其功能，在細(xì)胞活動(dòng)、信號(hào)傳導(dǎo)、穩(wěn)定細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)等多個(gè)方面發(fā)揮作用，在AD 的發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色[6-10]。最新研究表明[3,5]，鈣蛋白酶能夠調(diào)控tau 蛋白的截?cái)嘁约爱惓＿^(guò)度磷酸化。明確鈣蛋白酶與tau 蛋白異常翻譯后修飾之間的關(guān)系，有助于為抗AD 的新藥提供新的研究思路。本文對(duì)鈣蛋白酶的生理活性以及其對(duì)tau 蛋白磷酸化、去磷酸化和截?cái)嗟冗M(jìn)行綜述。

1 鈣蛋白酶的結(jié)構(gòu)

鈣蛋白酶是在體內(nèi)有廣泛表達(dá)的保守的特異性依靠Ca2+激活的中性半胱氨酸蛋白酶[11]。自40多年前發(fā)現(xiàn)以來(lái)，鈣蛋白酶家族的成員已經(jīng)與多種疾病的病理狀況相關(guān)，研究者們也對(duì)它們?cè)絹?lái)越關(guān)注。鈣蛋白酶家族共有15 個(gè)成員，它們大多數(shù)作為mRNA 被鑒定，有一些具有組織特異性[12-15]。引起研究者廣泛關(guān)注的有μ-calpain 和m-calpain，即在Ca2+濃度為μmol/L 和mmol/L級(jí)別下可以被激活的calpain 1和calpain 2[16]。

鈣蛋白酶由一個(gè)80 kDa 催化亞基和一個(gè)28 kDa 調(diào)節(jié)亞基組成[17-18]。其中大亞基由Capn1和Capn2基因編碼，具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域。小亞基由Capn4基因編碼，具有2 個(gè)結(jié)構(gòu)域。其中Capn4是calpain 1和calpain 2活性所需求的[19]。

2 鈣蛋白酶的活性調(diào)節(jié)

鈣蛋白酶的活性主要受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)節(jié)[20-21]。在未激活時(shí)，蛋白酶結(jié)構(gòu)域II 的兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(IIa 和IIb)是分開(kāi)的。鈣蛋白酶的激活主要有兩個(gè)階段。第一階段，在Ca2+的存在下，這兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合，發(fā)生構(gòu)象改變，這是激活鈣蛋白酶和形成活性催化位點(diǎn)的必要條件。Ca2+與結(jié)構(gòu)域III、IV 和VI中的EF-手性螺旋結(jié)合，從而將結(jié)構(gòu)域II 與結(jié)構(gòu)域III 分開(kāi)。因此，在第一階段結(jié)束時(shí)28 kDa 小亞基與80 kDa 大亞基解離。第二階段，蛋白酶結(jié)構(gòu)域II上的活性位點(diǎn)被重排，參與底物的水解過(guò)程[22]。鈣蛋白酶的活性也可以通過(guò)它的水解片段來(lái)反映。

鈣蛋白酶有超過(guò)100 種不同的底物，在正常生理?xiàng)l件下它們受到嚴(yán)格的控制，防止大量蛋白水解產(chǎn)生破壞性的后果。但是隨著年齡的增長(zhǎng)，尤其是患有糖尿病，肌營(yíng)養(yǎng)不良以及認(rèn)知障礙的患者，這種調(diào)節(jié)能力減弱，鈣蛋白酶的活性升高[8]。

鈣蛋白酶抑制劑(calpastatin,CS)是體內(nèi)唯一的特異性鈣蛋白酶家族抑制劑。在一項(xiàng)研究中calpain 2 的Ki值為10 nmol/L，證明CS對(duì)激活的鈣蛋白酶的親和力非常高[9]。在鈣蛋白酶未激活的正常生理?xiàng)l件下，CS 的缺乏不會(huì)導(dǎo)致生殖、發(fā)育或行為異常。相反，紅藻氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性會(huì)導(dǎo)致鈣蛋白酶催化的蛋白水解水平上調(diào)或下調(diào)，CS 敲除(CS-KO)和CS 過(guò)表達(dá)小鼠會(huì)發(fā)生神經(jīng)退行性變化，表明CS 在病理?xiàng)l件下可以抑制鈣蛋白酶的活性[23]。

3 鈣蛋白酶與tau蛋白

在AD 中出現(xiàn)的鈣蛋白酶激活，會(huì)引起Ca2+穩(wěn)態(tài)的紊亂，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[24]。有研究發(fā)現(xiàn)[15]，在AD 患者腦脊液中，蛋白酶的表達(dá)和活性升高，鈣蛋白酶的活化由可溶性β-淀粉樣蛋白激活N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)。另有研究表明[25]，鈣蛋白酶內(nèi)源性抑制劑CS 能抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。

AD患者腦內(nèi)tau蛋白磷酸化程度比普通人高3～4倍。tau蛋白磷酸化主要受磷酸激酶和磷酸酶的共同調(diào)節(jié)維持平衡，當(dāng)這種平衡被打破，會(huì)造成tau 蛋白異常過(guò)度磷酸化，過(guò)度磷酸化的tau 蛋白聚集能力顯著上升，失去原本的功能，以螺旋絲的形式聚集形成NFTs，造成神經(jīng)元的變性損傷[26]。鈣蛋白酶在tau 蛋白磷酸化和去磷酸化過(guò)程中起重要作用，并且對(duì)tau 蛋白的截?cái)嘁灿杏绊憽?/p>

3.1 鈣蛋白酶與tau蛋白磷酸化

糖原合成酶激酶3(gycogen synthase kinase 3,GSK3)是生物體內(nèi)廣泛分布的一種絲/蘇氨酸磷酸激酶，已知有GSK3α、GSK3β 兩種同工酶。其中，GSK3β 在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體內(nèi)均有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過(guò)程，如胚胎發(fā)育、凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖和細(xì)胞遷移等。GSK3β 是腦內(nèi)誘導(dǎo)tau 蛋白過(guò)度磷酸化的主要磷酸激酶，可促進(jìn)tau蛋白在多個(gè)與AD發(fā)生相關(guān)的位點(diǎn)磷酸化，例如Thr205、Thr212、Ser214、Thr217和Ser396/404 等[27-29]。SK3β 與AD 發(fā)病的主要病理機(jī)制有關(guān)，包括GSK3β 與Aβ 之間的相互作用[30]，可以磷酸化tau 蛋白[31]，可以與早老素和其他AD 蛋白相互作用，以及GSK3β對(duì)細(xì)胞凋亡的影響[32]。此外，GSK3β 參與記憶障礙的病變過(guò)程，抑制GSK3β 的活性，可改善學(xué)習(xí)和記憶。以上結(jié)果說(shuō)明，GSK3β具有影響細(xì)胞存活，調(diào)節(jié)神經(jīng)元可塑性、神經(jīng)元分化和基因表達(dá)的重要作用，GSK3β 可能是神經(jīng)退行性疾病如AD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素[30,33]。

calpain 1 和calpain 2 對(duì)GSK3β 的蛋白水解作用相似。通過(guò)calpain 1 截?cái)郍SK-3β 的C-末端(氨基酸382-433)顯著增強(qiáng)GSK3β 對(duì)tau 蛋白磷酸化的活性，從而導(dǎo)致AD 患者腦中tau 蛋白過(guò)度磷酸化和神經(jīng)原纖維變性。腦組織提取物與Ca2+共孵育發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶的激活可以使GSK3β 的抑制性結(jié)構(gòu)域N 末端被切割，表明鈣蛋白酶以某種方式促進(jìn)GSK3 截?cái)?，這種方式可能會(huì)影響信號(hào)傳導(dǎo)，并可能導(dǎo)致諸如AD等病理性疾病[34]。

相反，GSK3β不同位點(diǎn)的磷酸化可以影響鈣蛋白酶介導(dǎo)的切割作用[35]。GSK3β在Ser9位點(diǎn)的磷酸化可以消除鈣蛋白酶介導(dǎo)的C 末端和N 末端的切割，而GSK3β 在Ser389 位點(diǎn)的磷酸化僅抑制N末端切割[36]。

3.2 鈣蛋白酶與tau蛋白去磷酸化

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)是真核生物體內(nèi)的絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷酸酶，能使蛋白質(zhì)脫磷酸化，在tau 蛋白的脫磷酸化作用中，PP2A 占71%[8]。PP2A 是一種異源三聚體磷酸酶，由結(jié)構(gòu)亞基、調(diào)節(jié)亞基和催化亞基三個(gè)部分構(gòu)成。調(diào)節(jié)亞基有B/PR55、B'/PR61、B''/PR72、B'''/PR93 四種亞型，其分布具有組織特異性。在體內(nèi)，PP2A 有1/3以核心酶形式存在，剩下2/3以全酶形式存在。

PP2A 表達(dá)的失調(diào)可能加速AD 的發(fā)展。AD 患者腦中PP2A 活性顯著降低，在基因和蛋白質(zhì)水平上，PP2A 的各種亞基(如PP2Ac)表達(dá)均減少[37-38]。神經(jīng)元中tau 蛋白有多個(gè)絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)，它的過(guò)度磷酸化會(huì)影響微管的結(jié)合和解離，形成神經(jīng)內(nèi)NFTs，從而中斷微管網(wǎng)絡(luò)，引起認(rèn)知障礙。

在降低tau 蛋白過(guò)度磷酸化的過(guò)程中，鈣蛋白酶可以直接或間接作用于磷酸酯酶，主要表現(xiàn)為抑制PP2A 的表達(dá)。岡田酸處理和PP2A 催化亞基的沉默都可以減少饑餓誘導(dǎo)的FoxO3A 活化以及Capn4敲除的成纖維細(xì)胞的凋亡[39-40]。PP2A與Capn4敲除細(xì)胞中的Akt 更緊密地結(jié)合，表明PP2A 參與鈣蛋白酶介導(dǎo)的FoxO調(diào)節(jié)。PP2A調(diào)節(jié)亞基B56α和γ是鈣蛋白酶的體外底物，并且鈣蛋白酶調(diào)節(jié)體內(nèi)B56α 穩(wěn)定性，calpain 1的激活可以導(dǎo)致PP2A 調(diào)節(jié)亞基B56α 的截?cái)郲41]。calpain 2 在Ca2+的存在下可以將調(diào)節(jié)亞基B''/PR72α2 和B''/PR130α1 水解成45～48 kDa 蛋白片段('PR45')。鈣蛋白酶會(huì)減弱PR72 核心酶的相互作用，激活PP2A并顯著增加其對(duì)聚陽(yáng)離子的敏感性[42]。

3.3 鈣蛋白酶與tau蛋白的截?cái)?/h3>

在體外，calpain 1 在正常和患病位點(diǎn)均有特異性切割，并且位點(diǎn)的選擇是構(gòu)象依賴性的，tau 蛋白單體主要在G323/G326 (正常位點(diǎn))處切割，而tau 蛋白寡聚化增加AD 相關(guān)位點(diǎn)的切割[43]。tau 蛋白單體通過(guò)鈣蛋白酶介導(dǎo)的tau 蛋白截?cái)嗾T導(dǎo)神經(jīng)變性，導(dǎo)致17 kDa神經(jīng)毒性肽的積累和細(xì)胞凋亡[44]。

3.4 其他

在一些因素如興奮性毒素、缺氧和Ca2+內(nèi)流等的作用下，鈣蛋白酶會(huì)被激活，被激活的鈣蛋白酶可以將p35 剪切為p25，具有較高的磷酸化活性和神經(jīng)毒性的細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5 (cyclin-dependent kinase 5,CDK5)-p25 復(fù)合物，可以增強(qiáng)tau蛋白在Ser202和Thr205位點(diǎn)的磷酸化[13]。因此鈣蛋白酶的過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致NFTs的產(chǎn)生。

目前研究表明，在AD中鈣蛋白酶對(duì)tau蛋白過(guò)度磷酸化和截?cái)嘤兄苯踊蛘唛g接的作用，鈣蛋白酶有望成為治療AD 的新思路。因此，針對(duì)鈣蛋白酶對(duì)tau 蛋白磷酸化和截?cái)嗟淖饔脵C(jī)制的研究可能為AD的藥物治療打開(kāi)新局面。