姚國泰，王中志，王曉莉，朱成鳳，陳江漢

(1. 海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院皮膚科，上海 200003; 2. 聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院神經(jīng)外科，甘肅 蘭州 730050)

目前，隱球菌病的發(fā)病率在發(fā)展中國家尤其高，據(jù)統(tǒng)計，每年大約有100萬人感染，約65萬人在感染后3個月內(nèi)死亡[1]，使得新生隱球菌成為全球致死率最高的真菌。隱球菌病常見于實體器官移植受者、惡性腫瘤患者、艾滋病患者、靜脈注射吸毒者以及各種自身免疫性疾病需要免疫抑制藥物治療的人群[2-4]。隨著新的自身免疫和惡性腫瘤免疫抑制治療的發(fā)展，隱球菌病的高危感染人群正在擴大[5]。巨噬細胞是單核細胞分化的免疫吞噬細胞，幾乎存在于所有組織中，尤其在黏膜表面特別豐富，通過識別、吞噬和破壞病原體，在新生隱球菌入侵機體期間參與第一道免疫防線，并可將先天免疫與適應性免疫反應聯(lián)系起來，巨噬細胞可能是殺滅隱球菌及最終消除隱球菌感染的主要效應細胞[6]。在機體免疫受損的情況下，隱球菌會從肺擴散到大腦，導致致命的隱球菌性腦膜炎，治療困難，費用高。了解新生隱球菌和巨噬細胞之間相互作用的具體機制及可能結(jié)果，通過疫苗及預防性抗真菌治療提高先天免疫效率，對降低隱球菌病的發(fā)生至關(guān)重要。筆者對新生隱球菌和巨噬細胞間的相互作用進行綜述，包括新生隱球菌在巨噬細胞內(nèi)存活，避免吞噬機制，以及與巨噬細胞極化的關(guān)系，從而為隱球菌病的治療提供新思路和方法。

1 在巨噬細胞中的結(jié)局

了解新生隱球菌和巨噬細胞之間的相互作用是探索隱球菌性腦膜腦炎致病機制的基礎(chǔ)。理想情況下，新生隱球菌與巨噬細胞保持著復雜的相互作用，從而達到良好的平衡關(guān)系，利于機體的穩(wěn)態(tài)。研究[7]證實，在宿主中新生隱球菌和巨噬細胞共同存活，從而導致潛伏感染。巨噬細胞吞噬新生隱球菌后，新生隱球菌在吞噬體內(nèi)同時暴露于低pH值、低活性氧、低活性氮和營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中[8]，相應上調(diào)氧化應激酶、饑餓反應和自噬相關(guān)的基因表達，與自身黑色素和莢膜的抗氧化特性協(xié)同作用，從而有效地保護真菌免受宿主攻擊。新生隱球菌感染后在巨噬細胞中的結(jié)局至少包括吞噬、復制、非溶解性胞吐及橫向轉(zhuǎn)移。

1.1 吞噬作用 巨噬細胞對新生隱球菌的吞噬作用受多種因素介導。靶向莢膜葡糖醛酸木糖甘露聚糖(glucuronoxylomannan, GXM)的IgM和IgA促進補體非依賴及CD18依賴的吞噬作用[9]。在缺乏sIgM的小鼠中，肺巨噬細胞吞噬新生隱球菌的功能明顯受損[10]。與IgG1、IgM 和IgA不同，IgG3介導的吞噬作用與fcγ受體和CD18無關(guān)[11]。新生隱球菌的抗吞噬蛋白1(antiphagocytic protein, App1)與補體受體2/3(complement receptor, CR2/CR3)結(jié)合，抑制巨噬細胞的吞噬作用[12]。巨噬細胞的吞噬作用與隱球菌性腦膜腦炎患者的高死亡率之間存在聯(lián)系[13]，對新生隱球菌的有效吞噬將導致疾病預后不良[14]。

1.2 復制 Diamond等[15]首先描述了新生隱球菌的胞內(nèi)復制，觀察到人類巨噬細胞內(nèi)新生隱球菌的復制速度比在細胞外快。作為一種兼性細胞內(nèi)病原體，新生隱球菌在巨噬細胞內(nèi)復制并堿化巨噬細胞的吞噬體，導致吞噬體破裂及巨噬細胞溶解[16]。新生隱球菌的增殖也可能刺激一些巨噬細胞的有絲分裂[17]，但在長期的新生隱球菌感染中，隱球菌酵母能特異性地抑制細胞周期蛋白D1表達[18]，從而減少巨噬細胞有絲分裂[19]。因此，新生隱球菌的復制和巨噬細胞裂解/有絲分裂平衡背后的機制仍然需要探索。

1.3 排出 當新生隱球菌在巨噬細胞內(nèi)存活時，某些機制允許其從巨噬細胞中排出，因此可能會增加組織中的真菌負擔。新生隱球菌的增殖可促進巨噬細胞的溶解，從而進入組織[20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)在小鼠和人類巨噬細胞中，新生隱球菌在不殺死宿主細胞的情況下排出巨噬細胞的新機制[21]，此過程稱為非溶解性胞吐作用。這種排出可能發(fā)生在吞噬病原體數(shù)小時后，整個過程持續(xù)小于5 min[22]。實時成像證實該過程依賴活酵母細胞[23]，因為新生隱球菌分泌的毒力因子磷脂酶B1(phospholipase B1, PLB1)和SEC14基因，對于非溶解性胞吐是必需的[24]?？张軦TP酶抑制劑，Arp2(actin-related proteins 2, Arp2)復合物介導的肌動蛋白聚合，Th1和Th17細胞因子，以及自噬基因的敲除能抑制非溶解性胞吐作用，氯化銨和氯喹以及Th2細胞因子增加非溶解性胞吐作用[25-27]，可能導致新生隱球菌的排出和疾病的加重。

1.4 橫向轉(zhuǎn)移 活的新生隱球菌也可以從一個巨噬細胞轉(zhuǎn)移到另一個巨噬細胞[28]，并且與酵母細胞的內(nèi)吞途徑相互獨立。與非溶解性胞吐相比，橫向轉(zhuǎn)移是一個肌動蛋白依賴過程，可以被細胞松弛素D抑制。橫向轉(zhuǎn)移可能在新生隱球菌潛伏期間反復發(fā)生，從而避免被免疫系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，防止被抗真菌藥物殺滅。

2 抗吞噬作用

避免吞噬以逃避氧化應激和營養(yǎng)缺乏是新生隱球菌發(fā)病機制的核心。逃避吞噬作用的一種方法是通過改變其細胞形態(tài)，增大后的新生隱球菌菌體體積是酵母樣新生隱球菌體積的5～10倍，被成為“titan cell”[29]。由于巨噬細胞不能攝取這些巨型酵母細胞，使新生隱球菌在巨噬細胞外定植，從而易于侵入組織。新生隱球菌在組織表面形成生物膜和水通道結(jié)構(gòu)，保護新生隱球菌免受組織抗微生物作用及巨噬細胞吞噬作用，增強真菌抗性、群體感應和存活能力[30]。新生隱球菌也表達App1，其特異性抑制補體受體CR3的CD11b結(jié)構(gòu)域，阻止CR3的配體iC3b被吞噬[31]，因為抗體調(diào)理素化的細胞通過Fc受體內(nèi)化而非CR3，故App1不能抑制抗體介導的吞噬作用[31]。此外，帶負電荷的新生隱球菌莢膜有助于產(chǎn)生靜電排斥力，阻止細胞與細胞因接觸而被吞噬[32]。

在肺組織環(huán)境中，直徑50～100 μm的巨型新生隱球菌細胞(超過標準酵母型10倍)有不同厚度的莢膜，使其對吞噬作用具有抗性[29]。此外，新生隱球菌莢膜還具有掩蓋其病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的功能，避免被宿主細胞上的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)識別，從而逃避免疫系統(tǒng)，防止被吞噬?？傊律[球菌已發(fā)展出多種機制來避免被巨噬細胞內(nèi)化，其中一些依賴于莢膜，另一些依賴于抗吞噬蛋白和信號傳導途徑，因此，可以作為研究病原微生物與吞噬細胞相互作用的良好模型。

3 在巨噬細胞內(nèi)存活的機制

新生隱球菌在吞噬細胞內(nèi)殺傷及存活的能力，不僅對真菌的增加有重要影響，也對感染期間的真菌負擔和傳播有直接影響。已發(fā)現(xiàn)多種病原體在巨噬細胞內(nèi)存活的機制，包括抑制吞噬體-溶酶體融合或避免被吞噬溶酶體殺滅。新生隱球菌的吞噬會形成較大的吞噬溶酶體[33]。電子顯微鏡觀察到吞噬溶酶體膜上存在空穴，表明含有新生隱球菌的吞噬溶酶體發(fā)生了泄漏[16]，這些數(shù)據(jù)表明，盡管發(fā)生了吞噬溶酶體的融合，但新生隱球菌有能力削弱其功能，保證新生隱球菌在其中生存和復制，而且胞內(nèi)新生隱球菌抑制一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，而NO對殺滅吞噬的病原體起重要作用。莢膜多糖是新生隱球菌的主要毒力因子，對避免和干擾巨噬細胞的正常功能起著重要作用。莢膜是隱球菌胞內(nèi)生存所必需的，無莢膜突變體不能在巨噬細胞內(nèi)復制。莢膜可根據(jù)環(huán)境條件改變大小，在感染過程中，莢膜顯著增大。研究[34]表明，巨噬細胞提取物也可以誘導莢膜增大。巨噬細胞對于隱球菌病的早期控制至關(guān)重要，在被巨噬細胞吞噬的前2 h新生隱球菌多糖莢膜較小。隨著莢膜的擴大，巨噬細胞的吞噬作用及對新生隱球菌的控制能力被限制。由于莢膜多糖具有抗氧化特性，因此，莢膜增大有助于避免新生隱球菌被殺滅。莢膜增大的細胞對自由基和抗菌肽的敏感性降低，表明莢膜增大通過一種“緩沖”或“捕獲”機制來應對吞噬體的應激狀態(tài)[35]。莢膜變大還可以增大吞噬溶酶體的大小，稀釋溶酶體內(nèi)容物避免新生隱球菌被殺滅。此外，F(xiàn)eldmesser等[36]觀察到，在含有新生隱球菌酵母的吞噬溶酶體中，酵母細胞和吞噬溶酶體膜之間存在物理隔離。許多抗菌化合物是從膜上釋放出來的，莢膜增大也可能有助于避免新生隱球菌被這些分子殺滅。由此可見，莢膜通過體積增大及結(jié)構(gòu)變化來增強新生隱球菌抵抗外界環(huán)境的能力。

新生隱球菌具有多種內(nèi)在物質(zhì)，如莢膜、黑色素和抗氧化酶，能抵抗吞噬溶酶體的殺傷作用。此外新生隱球菌的胞外產(chǎn)物甘露醇和鞘脂，對抵抗巨噬細胞的殺菌作用及促進細胞內(nèi)生存有一定的幫助[37]。 新生隱球菌還可通過產(chǎn)生胞外莢膜多糖干擾吞噬溶酶體和巨噬細胞的功能，從而在巨噬細胞內(nèi)存活。

研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞自身吞噬體的酸化有利于新生隱球菌在低pH值條件下存活和增殖[38]，用氯喹處理巨噬細胞后，吞噬體pH值增加，導致新生隱球菌的增殖率降低[39]。鼠RAW264.7巨噬細胞自噬基因ATGs (ATG5、ATG9a、ATG12)參與對新生隱球菌的吞噬過程，在感染15 h后，ATG2a、ATG5、ATG9a、ATG12和LC3增強新生隱球菌在巨噬細胞內(nèi)的復制及逃逸能力[40]。而敲除Atg2、Atg5或Atg9后，新生隱球菌的吞噬和/或復制顯著減少，Atg5自噬基因的敲除同時減少新生隱球菌的非溶解性胞吐[27]。

4 新生隱球菌感染與巨噬細胞極化的關(guān)系

成功根除新生隱球菌感染需要獨特的適應性免疫應答。肺泡和肺組織中浸潤的巨噬細胞吞噬并殺滅入侵的病原體，并且能將抗原呈遞給活化的T細胞，以刺激免疫活性個體的適應性免疫應答。巨噬細胞具有動態(tài)可塑性，能根據(jù)細胞因子微環(huán)境的變化而改變其活化表型。巨噬細胞活化表型大致分為經(jīng)典型(M1)或替代型(M2)。M1巨噬細胞通過產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)和活性氮(reactive nitrogen species, RNS)介導宿主防御微生物病原體。誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)作用于底物L-精氨酸，產(chǎn)生NO，具有抗隱球菌特性[41]。相反，精氨酸酶-1(Arginase-1, Arg-1)是M2巨噬細胞活化的標志性標記物，與iNOS競爭產(chǎn)生L-鳥氨酸和尿素的底物。Arg-1與iNOS的比例通常被認為是巨噬細胞極化表型的指標，因為活化M2巨噬細胞的條件抑制M1巨噬細胞活化。白細胞介素(IL)-4和IL-13細胞因子介導M2巨噬細胞的活化。一種由新生隱球菌分泌的熱休克蛋白70同源物Ssa1，通過刺激IL-4和IL-13產(chǎn)生促進早期真菌生長及向M2巨噬細胞活化的轉(zhuǎn)變[42]。M2巨噬細胞有助于抑制和調(diào)節(jié)炎癥反應，并在傷口愈合中起關(guān)鍵作用，但不具有抗新生隱球菌作用[41]。新生隱球菌可以在M2巨噬細胞中存活，并將其作為逃避宿主識別及殺滅的保護性媒介[43]。幾丁質(zhì)作為新生隱球菌細胞壁的組成部分，間接刺激IL-5和IL-13的產(chǎn)生，并可引發(fā)IL-4的產(chǎn)生，導致M2巨噬細胞活化[44]，從而避免新生隱球菌被殺滅。

在干擾素(IFN)-γ存在下，用IL-4刺激向M1表型極化的巨噬細胞可以將其重新極化為M2表型。類似地M2表型的巨噬細胞可以在IFN-γ的存在下重新極化為功能性M1表型，并且能維持抗新生隱球菌活性[45]，此標志著局部細胞因子可以驅(qū)動巨噬細胞的極化。Th1型T細胞和NK細胞產(chǎn)生的 IFN-γ可以通過刺激信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT1)依賴的方式激活M1巨噬細胞[46]，已證實STAT1信號傳導是M1巨噬細胞活化和保護所必需的[41]。但最近一項臨床研究[47]表明，盡管2例非HIV隱球菌性腦膜炎患者腦中IFN-γ水平和促炎因子水平升高，巨噬細胞卻極化為吞噬能力較差的非保護性的M2表型，表明在人類新生隱球菌感染中巨噬細胞的極化非常復雜，且需要進一步研究。

新生隱球菌對M1巨噬細胞產(chǎn)生的NO敏感[48]，但可以通過下調(diào)巨噬細胞iNOS RNA的表達，從而抑制NO的產(chǎn)生[49]，抑制iNOS導致M2巨噬細胞活化，造成抗隱球菌活性喪失和疾病進展[48]。此外，iNOS缺陷小鼠或用iNOS抑制劑處理的野生型小鼠的巨噬細胞，即使在ROS存在時也不能控制新生隱球菌的細胞內(nèi)增殖[41]，表明M1巨噬細胞利用NO，而不是ROS在小鼠中控制新生隱球菌的胞內(nèi)增殖。然而，此發(fā)現(xiàn)是否適用于人類巨噬細胞仍存在爭議，因為人類iNOS基因通常通過CpG甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)壓縮被沉默[50]。其他研究顯示，人類肺組織中的肉芽腫和非人靈長類動物體內(nèi)含有iNOS陽性的巨噬細胞[51-52]，表明人類巨噬細胞能產(chǎn)生控制新生隱球菌生長的NO。為解決這個問題，需要進一步研究人類巨噬細胞對新生隱球菌感染的應答。

從治療的角度來看，進一步剖析新生隱球菌感染期間巨噬細胞極化的信號傳導機制，可以幫助誘導巨噬細胞向抗隱球菌表型的極化，并為抗隱球菌的保護性應答提供新的研究方向。 已知多種信號組分參與巨噬細胞極化，包括DAP12(DNAX-activating protein of 12kDa)[53]、HSP70(heat shock protein 70)[44]和STAT1,研究其他細胞內(nèi)病原體，發(fā)現(xiàn)TLR(Toll-Like receptor, TLR)信號傳導可誘導巨噬細胞中Arg1的產(chǎn)生[54]，了解這些過程將有助于揭示哺乳動物中巨噬細胞極化對新生隱球菌感染結(jié)局的影響，并為治療隱球菌病提供新的疫苗及免疫治療方案。

5 結(jié)論及展望

巨噬細胞與新生隱球菌的相互作用是復雜的宿主與病原體關(guān)系中的一部分，這種關(guān)系對于感染的早期控制和清除至關(guān)重要。新生隱球菌可以逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)察或調(diào)節(jié)宿主細胞，從而在巨噬細胞內(nèi)存活和復制。而關(guān)于新生隱球菌如何與巨噬細胞相互作用，以及如何調(diào)節(jié)及逃避免疫應答，達到病原體與宿主之間的相對平衡，對于確定免疫反應的進行和疾病的結(jié)局至關(guān)重要。未來的研究可以集中在確定新生隱球菌和巨噬細胞之間特定分子的相互作用或信號通路的傳導，以及這些相互作用如何導致疾病的發(fā)生、發(fā)展，巨噬細胞極化條件的控制等，充分了解隱球菌病潛伏狀態(tài)與播散狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換的重要特征，為開發(fā)以巨噬細胞為靶點的新型疫苗和免疫療法來預防和治療隱球菌病奠定重要基礎(chǔ)。