田雅娟，李欽青，杜 娟，張曉燕，賀文彬

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 太原 030024)

化妝品在存儲和使用過程中，極易受到微生物的污染而導(dǎo)致腐敗。為了使其在保質(zhì)期及使用過程中不被污染，需要添加一定量具有抑菌功效的成分[1～2]。由于化妝品的成分復(fù)雜，包括油性原料、粉質(zhì)原料和水溶性聚合物等，其中干擾防腐劑作用效果的因素比較廣泛，因此防腐劑種類的選擇或復(fù)配是化妝品研制過程中的一個重要環(huán)節(jié)[3～4]?！痘瘖y品安全技術(shù)規(guī)范》[5](2015版)對于51種允許添加的防腐劑的使用劑量都做了明確限制，以此來預(yù)防潛在風(fēng)險。因此如何減少防腐劑的用量，降低致敏性的同時保證產(chǎn)品質(zhì)量，平衡防腐劑用量和其抑菌效果顯得尤為重要[6～7]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于市售化妝品微生物污染狀況調(diào)查研究表明，微生物指標(biāo)不合格的產(chǎn)品仍占有一定比例[8～9]。為了保障化妝品的品質(zhì)安全，添加防腐劑成為抑制微生物污染的主要手段，防腐劑添加量過少，易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，添加量過多，會對人體安全產(chǎn)生影響，因此防腐方案選擇以及防腐效果評價必不可少。常被用作保濕劑及溶劑的1,2-己二醇目前在個人護(hù)理品工業(yè)中也已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，其保濕性和安全性已得到驗(yàn)證，同時顯示出了一定的抗微生物效果[10]。筆者以1,2-己二醇為研究對象，通過微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，測試1,2-己二醇及其與1,2-戊二醇、1，3丁二醇的復(fù)配方案在乳劑型樣品中單獨(dú)及復(fù)配使用的防腐效果，并與杰馬BP進(jìn)行比較，以期為開發(fā)具有高效防腐效果的無防腐劑化妝品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

大腸桿菌ATCC 8739(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；綠膿桿菌ATCC 9027(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；金黃色葡萄球菌ATCC 6538(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；白色念珠菌ATCC 10231(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；黑曲霉菌ATCC 16404(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；人參花(山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；紫草(山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；當(dāng)歸(山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；虎杖(山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；地榆(山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房)；丁二醇(OXEA公司)；甘油(德國EMERY公司)；甜菜堿(美國安格公司)；環(huán)聚二甲基硅氧烷(美國DOWCORNING公司)；鯨蠟硬脂醇(法國SEPPIC公司)；透明質(zhì)酸(山東福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司)；霍霍巴酯類(美國FLORATECH公司)；膠原蛋白(法國羅賽洛公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技儀器有限公司)；1,2-戊二醇(廣州廣曼生物科技有限公司)；1,2-己二醇(廣州廣曼生物科技有限公司)；杰馬BP(北京桑普生物化學(xué)技術(shù)有限公司)；1，3-丁二醇(山東西亞化學(xué)股份有限公司)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技儀器有限公司)；霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；恒溫恒濕箱(施都凱儀器設(shè)備上海有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

預(yù)先配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 % 的卡波姆水溶液，將油相和水相分別升溫至85 ℃，攪拌至溶解均勻，抽油乳化10 min，降溫至55 ℃加入預(yù)配制溶液，再次降溫至40 ℃加入氨甲基丙醇中和，攪拌至混合均勻。實(shí)驗(yàn)用乳液基質(zhì)為本實(shí)驗(yàn)室自制的樣品，生產(chǎn)過程經(jīng)過嚴(yán)格的無菌控制，基質(zhì)成分及含量如表1所示。

表1 乳液配方

1.2.1 實(shí)驗(yàn)用菌液的配制

各取一株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別接種到普通斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌所需溫度(36±1)℃，恒溫培養(yǎng)48 h，霉菌(28±1)℃，恒溫培養(yǎng)5 d，用少量的生理鹽水分別將斜面上的菌苔洗出，充分搖勻，經(jīng)適當(dāng)稀釋分別制成109cfu/mL混合細(xì)菌懸液和107cfu/mL混合霉菌懸液，置于冰箱4 ℃冷藏備用。進(jìn)行微生物挑戰(zhàn)試驗(yàn)前，測定乳液基質(zhì)中細(xì)菌、霉菌含量，確保其數(shù)值小于10 cfu/g或10 cfu/mL[11]。

1.2.2 微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)參考美國藥典(USP)[12]化妝品、盥洗用品與香料協(xié)會(CTFA)[13]以及中國藥典(2015年版三部)的微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)方法，即在乳劑樣品中添加一定量的微生物菌懸液，每間隔一段時間用平板計(jì)數(shù)法檢測微生物的存活情況，觀察28 d后，判斷防腐劑的防腐效果。

測試不同防腐方案的抑菌效果，四種方案分別為：方案一：1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %；方案二：杰馬BP 0.3 %；方案三：1,2-己二醇3 %；方案四：1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %。

稱取各受試樣品20 g于滅菌50 mL離心管內(nèi)，分別添加 0.2 mL 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、黑曲霉菌和白色念珠菌的菌懸液，使受檢樣品取得最終含菌量：細(xì)菌3.0×106～3.0×107cfu/g或cfu/mL、霉菌1.0×104～1.0×105cfu/g或cfu/mL，充分混勻，將樣品置于(28±1)℃條件下，于接菌后 0 d、7 d、14 d、21 d、28 d用平板計(jì)數(shù)法檢測微生物的生長情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下：按照化妝品、盥洗用品與香料協(xié)會(CTFA)標(biāo)準(zhǔn)要求，當(dāng)細(xì)菌在7 d之內(nèi)至少減少99.9 %，并且測試7 d～28 d沒有增加;霉菌在7 d之內(nèi)應(yīng)該至少減少90 %，并且測試7 d～28 d沒有增加判定為挑戰(zhàn)通過。

2 結(jié) 果

四種不同的防腐方案抑菌效果如表2所示，細(xì)菌在7 d之內(nèi)下降率均大于99.9 %，并且測試7 d～28 d沒有增加；霉菌在7 d 之內(nèi)下降率均大于90 %，并且測試7 d～28 d沒有增加。四種防腐方案均可通過微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，第7天菌數(shù)的下降率以及28 d內(nèi)菌數(shù)的變化趨勢如表3所示。

方案(1)中，黑曲霉菌第7天菌落的數(shù)量由9.1×105cfu/mL下降至1.4×103cfu/mL，第14天為3.0×102cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率為99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d 呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；綠膿桿菌第7天菌落的數(shù)量由1.1×107cfu/mL下降至1.2×103cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；混合菌第7天菌落的數(shù)量由5.6×106cfu/mL下降至9.0×102cfu/mL，第14天下降至20 cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢。

方案(2)中，黑曲霉菌第7天菌落的數(shù)量由9.1×105cfu/mL下降至50 cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率為99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；綠膿桿菌第7天菌落的數(shù)量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d時下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；混合菌第7天菌落的數(shù)量由5.6×106cfu/mL下降至6.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢。

方案(3)中，黑曲霉菌第7天菌落的數(shù)量由9.1×105cfu/mL下降至4.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率為99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；綠膿桿菌第7天菌落的數(shù)量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d時下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；混合菌第7天菌落的數(shù)量由5.6×106cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢。

方案(4)中，黑曲霉菌第7天菌落的數(shù)量由9.1×105cfu/mL下降至2.4×103cfu/mL，第14天為2.0×102cfu/mL，第21天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率為99.8 %，大于90 %，在7 d～28 d 呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；綠膿桿菌第7天菌落的數(shù)量由1.1×107cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢；混合菌第7天菌落的數(shù)量由 5.6×106cfu/mL下降至5.0×102cfu/mL，第14天下降至小于10 cfu/mL，7 d下降率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于90 %，在7 d～28 d呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:四種方案中，第7天白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌落的數(shù)量分別由8.0×105cfu/mL、7.3×106cfu/mL及6.8×106cfu/mL下降至小于10 cfu/mL，第7天時霉菌數(shù)量降低90 %，細(xì)菌數(shù)量降低99.9 %，并且28 d內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降。

表2 微生物挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn)

表3 微生物挑戰(zhàn)測試結(jié)果

四種方案第7天黑曲霉菌菌落數(shù)量分別為1.4×103cfu/mL、50 cfu/mL、4.0×102cfu/mL、2.4×103cfu/mL，第14天黑曲霉菌菌落數(shù)量分別為3.0×102cfu/mL、小于10 cfu/mL、小于10 cfu/mL、2×102cfu/mL，抑菌效果最強(qiáng)的是杰馬BP 0.3 %和1,2-己二醇3 %，其次是1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %，再次是1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %。如圖1所示。

圖1 微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)結(jié)果-黑曲霉菌

四種方案第7天混合菌落數(shù)量分別為9.0×102cfu/mL、6.0×102cfu/mL、10 cfu/mL、5.0×102cfu/mL，第14天混合菌落數(shù)量分別為20 cfu/mL、小于10 cfu/mL、10 cfu/mL、小于10 cfu/mL。抑菌效果由強(qiáng)到弱分別是1,2-己二醇3 %、1,2-戊二醇0.5 %+1,2-己二醇1.5 %+1，3-丁二醇5 %、杰馬BP 0.3 %、1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %。如圖2所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：分別添加了1,2-戊二醇1 %+1,2-己二醇2 %、杰馬BP 0.3 %、1,2-己二醇(3 %)、1,2-己二醇(1.5 %)+1,2-戊二醇(0.5 %)+1，3丁二醇(5 %)的樣品中，在第7天時霉菌數(shù)量降低90 %，細(xì)菌數(shù)量降低99.9 %，并且28 d內(nèi)菌數(shù)持續(xù)下降。四種防腐方案均通過了微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)。

3 結(jié) 論

化妝品防腐劑的使用目的在于殺滅微生物或抑制其生長，維持化妝品的保存及使用期限，高效安全的防腐體系是穩(wěn)定化妝品配方的關(guān)鍵之一。1,2-己二醇無色無味，以往的研究表明，其可以起到提高皮膚水分含量、增加其他物質(zhì)溶解度的作用，適用于絕大多數(shù)的化妝品體系當(dāng)中，不會受到極端的溫度及pH值的影響，液體穩(wěn)定性強(qiáng)，具有一定的抑菌效果[11]。1,2-戊二醇溫和不刺激，適用于敏感性皮膚、嬰幼兒等柔嫩皮膚及衰老干燥皮膚的護(hù)理。其在大范圍pH值下穩(wěn)定，與多數(shù)化妝品成分相容，一般作為保濕劑、抗菌劑和增溶劑使用。1，3丁二醇在化妝品中常作保濕劑和溶劑使用，也具有一定的抑菌作用。目前烷基二元醇在化妝品中已得到了廣泛應(yīng)用，具有優(yōu)異的保濕性和安全性，同時也有研究表明其具有一定的抗微生物性能。本研究通過微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，驗(yàn)證了1,2-己二醇以及其與1,2-戊二醇、1，3-丁二醇的復(fù)配防腐方案在乳劑型樣品中的抑菌效果，四種防腐方案均順利通過了微生物挑戰(zhàn)性試驗(yàn)，在第7天對于細(xì)菌的抑制率都達(dá)到了99.9 %，對于霉菌的抑制率達(dá)到了90 %。

1,2-己二醇、1,2-戊二醇及1，3-丁二醇廣泛被作為保濕劑和增溶劑使用，然而其在使用及研究過程中顯示出了很好的防腐效果。不同微生物對不同抗菌劑的敏感性差異較大，因此復(fù)配方案更能夠滿足需求，將1,2-己二醇、1，3-丁二醇和1,2-戊二醇復(fù)配代替?zhèn)鹘y(tǒng)防腐劑的報(bào)道并不多見，筆者以1,2-己二醇為研究對象，通過測試1,2-己二醇在乳劑型基質(zhì)中單獨(dú)及復(fù)配使用的防腐效果，提出復(fù)配防腐體系方案，以期為開發(fā)高效的無防腐劑特殊用途化妝品提供依據(jù)。