賈 穎，王佳敏，楊大偉，高 思

(山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619)

銀屑病，祖國醫(yī)學(xué)稱“白疕”，是一種以紅色斑疹或丘疹為主，在其表面上覆蓋有多層的銀白色鱗屑的慢性炎癥性，且容易復(fù)發(fā)的疾病，皮損不僅僅局限于某一部位，并且可以廣泛散播于全身[1～2]，本病的病理改變以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生、炎性浸潤為主，嚴(yán)重影響著患者的身體和心理的健康。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，白疕的病因病機亦十分復(fù)雜,隨著對白疕的認(rèn)識不斷加深，原有理論得到新的闡發(fā)，新的理論不斷涌現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，銀屑病主要以血熱、血虛、血燥、血瘀為本，濕熱蘊結(jié)為標(biāo)。有報道[3]認(rèn)為，銀屑病可能是由多種致病因素通過多種傳染途徑引起人體表皮細(xì)胞增殖、角化不全、炎癥反應(yīng)的多基因疾病。尋常型銀屑病是一種慢性、常見并易復(fù)發(fā)的 T 淋巴細(xì)胞免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，影響患者的身心健康[4～5]。對銀屑病的診斷較為容易，但目前仍然缺乏毒副作用小、臨床效果穩(wěn)定可靠的治療方法。因此，本病的治療一直受到國內(nèi)外醫(yī)師關(guān)注，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于本病發(fā)病機制尚不明確，治療方法各有所長，但總體而言，緩解病情者居多，但是停藥一段時間后復(fù)發(fā)率比較高，且副作用較大。這就推動臨床醫(yī)家尋求運用中醫(yī)藥理論來指導(dǎo)治療本病，在運用中藥口服的同時配合中醫(yī)特色的外治療法，比如中藥的藥浴法、濕敷法、穴位埋線及穴位注射、體針及灸法、耳針、刺絡(luò)拔罐放血療法等，在治療上取得了一定的效果。查閱大量文獻(xiàn)及臨床觀察發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方的治療作用相對緩和，個體化治療，因人而異，遠(yuǎn)期療效好且復(fù)發(fā)率相對低，副作用較少，對彌補現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不足，可能存在一定的優(yōu)勢。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，結(jié)合藥理學(xué)、生物信息學(xué)、網(wǎng)絡(luò)分析等多個學(xué)科內(nèi)容，從整體出發(fā)研究及闡釋中藥成分-靶點-疾病間之間的關(guān)系，選取特定信號節(jié)點(Nodes)進(jìn)行多靶點藥物分子設(shè)計的新學(xué)科?？捎糜谙到y(tǒng)反映中藥復(fù)方作用機理，并指導(dǎo)新藥合成[6]。秦柏洗液是在古方“秦皮、楮桃葉外洗劑”的基礎(chǔ)上加減而成，臨床觀察其對尋常型銀屑病的皮損的改善有顯著的療效，為了探討該方的作用機理，因此結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)展開了本次的研究。

1 方 法

1.1 活性成分篩選

通過TCMSP(Traditional chinese medicine systems pharmacology databaseand analysis platform)數(shù)據(jù)庫對當(dāng)歸、秦皮、側(cè)柏葉、桑葉的藥物有效成分進(jìn)行篩選，以口服生物利用度(OB≥30 %)、血腦屏障(BBB≥-0.3)、Drug-Likeness(DL≥0.18)為標(biāo)準(zhǔn)篩選出對應(yīng)的藥物有效成分。

1.2 藥物活性成分靶點的獲取

在TCMSP中通過PubChem CID超鏈接進(jìn)入PubChem數(shù)據(jù)庫獲取成分的SMILES結(jié)構(gòu)式及2D/3D結(jié)構(gòu)，將SMILES結(jié)構(gòu)式輸入SWISS數(shù)據(jù)庫中即可獲得藥物成分靶點。

1.3 疾病靶點的獲取

在TTD數(shù)據(jù)庫中Search drugs and targetsby disease or ICD identifier一欄輸入皮膚炎性的英文名稱(skin inflammatory)獲得1個疾病一級靶點。將這1個一級靶點在STRING數(shù)據(jù)庫中進(jìn)一步搜索獲取更具體的疾病靶點。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.1 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 Cytoscape 軟件(本試驗采用Cytoscape 3.7.1版本)將主要活性成分的名稱及其對應(yīng)的靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入生成成分靶點網(wǎng)絡(luò)。通過Bisogenet插件選擇需要的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫后輸入基因列表構(gòu)建成分靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

2.2 疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將疾病靶點數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape得到疾病靶點網(wǎng)絡(luò), 通過Bisogenet插件選擇需要的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫后輸入基因列表構(gòu)建疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)。原則為物種為智人(Homo Sapiens)。

3 生物通路分析

將利用Bisogenet插件構(gòu)建的成分靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，用Cytoscape中的merge工具做一個PPI網(wǎng)絡(luò)的交集得到一個成分靶點和疾病靶點的交集網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape中的CytoNCA插件對該網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行評估分析，選擇degree值≥2倍中位數(shù)的靶點，作為核心靶點得到一個更細(xì)致的交集網(wǎng)絡(luò)。使用ClueGO插件對核心靶點進(jìn)行富集分析，選擇正確的功能、種屬和圖像展示方式，默認(rèn)選擇P<0.05，粘貼基因開始分析，得到富集分析網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)出結(jié)果報告獲得富集分析餅狀圖，對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析討論。

4 結(jié) 果

4.1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中藥有效成分篩選

如表1所示，以O(shè)B≥30 %、DL≥0.18、BBB≥-0.3作為篩選條件得到10個活性成分。

表1 當(dāng)歸、秦皮、側(cè)柏葉、桑葉藥材的10個活性成分

4.2 成分靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的10個活性成分和其對應(yīng)靶點相連構(gòu)建成分靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖(如圖1),其中黃色節(jié)點代表10個活性成分、綠色節(jié)點代表靶點，而邊則表示活性成分與靶點的相互作用關(guān)系。通過Bisogenet插件構(gòu)建的成分靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，粉紅色節(jié)點代表靶點共57個，如圖2。

圖1 成分靶點可視化網(wǎng)絡(luò)

圖2 成分靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

4.3 疾病靶點網(wǎng)絡(luò)

將篩選出的疾病靶點相連構(gòu)建疾病靶點可視化網(wǎng)絡(luò)圖(如圖3),其中節(jié)點代表PARP1是一級靶點、其余是潛在靶點。通過Bisogenet插件構(gòu)建的疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖4。

圖3 疾病靶點可視化網(wǎng)絡(luò)

圖4 疾病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

4.4 交集網(wǎng)絡(luò)

用Cytoscape中的merge工具做一個PPI網(wǎng)絡(luò)的交集得到57個成分靶點和1個疾病靶點的交集網(wǎng)絡(luò)如圖5，共118個節(jié)點。根據(jù)數(shù)據(jù)顯示該交集網(wǎng)絡(luò)的degree中位值為17，設(shè)定篩選范圍為degree值大于等于34，共17個節(jié)點，如圖6。

圖5 merge交集網(wǎng)絡(luò)

圖6 以degree≥34為標(biāo)準(zhǔn)篩選的交集網(wǎng)絡(luò)

4.5 CLUEGO富集分析結(jié)果

將以degree≥34為標(biāo)準(zhǔn)篩選的交集網(wǎng)絡(luò)核心靶點的基因鍵入CLUEGO中得到富集分析圖圖7、圖8、圖9，餅狀圖顯示的生物通路類型共15種，柱狀圖顯示每種通路類型中具體有哪些通路。

圖7 富集分析圖

圖8 CLUEGO富集分析餅狀圖

圖9 CLUEGO富集分析柱狀圖

對以上分析數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)可知：modulation by host of viral transcription、regulation of protein sumoylation、positive regulation of pri-miRNA transcription by RNA polymerase II、positive regulation of type I interferon production、positive regulation of DNA-templated transcription, initiation等5條信號通路是研究當(dāng)歸、秦皮、桑葉、側(cè)柏葉治療皮膚炎性作用機制的重點研究方向。

病毒轉(zhuǎn)錄宿主的調(diào)節(jié)通路(modulation by host of viral transcription)：病毒在入侵宿主的過程中，通過釋放刺激因子致使宿主細(xì)胞激活以使其完成進(jìn)入、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的過程，而機體也會啟動自身的免疫系統(tǒng)抵御這種“異物”的入侵。藥物成分影響病毒的復(fù)制、免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等環(huán)節(jié)，分別參與免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的分泌，降低炎性因子的表達(dá)，最終達(dá)到抑制病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的目的。

5 典型病例

南×，女，23歲，2018年10月9日初診。主訴：全身散在紅色斑丘疹，以頭部、雙下肢為甚5 a?，F(xiàn)病史：患者5 a前無明顯誘因發(fā)現(xiàn)全身散在紅丘疹，上覆鱗屑伴偶有瘙癢，經(jīng)當(dāng)?shù)乜h醫(yī)院診斷為“銀屑病”，治療用藥不詳，5 a期間經(jīng)多種手段治療效果均不明顯，后自行長時間以哈西奈德乳膏外抹頭部皮損區(qū)，為求進(jìn)一步治療，遂于我院門診治療。癥見:全身散在紅色斑丘疹，上覆銀白色鱗屑，略癢，偶見紅丘疹上覆有黃痂；頭部皮疹厚約一元硬幣厚度，脫大量淡黃白色片狀鱗屑。食欲可，眠佳，二便調(diào)。舌質(zhì)暗紅，苔薄微黃，脈滑數(shù)。診斷：白疕(血熱內(nèi)蘊證)。治法：涼血清熱，利濕消斑。治以土槐丹四物湯加味加減，土茯苓30 g，生地30 g，當(dāng)歸30 g，地骨皮15 g，生槐花30 g，白鮮皮10 g，牡丹皮30 g，白蒺藜10 g，徐長卿15 g，川木瓜10 g，生甘草6 g，蟬蛻6 g，上方隨癥加減。同時配合秦柏洗液(秦皮30 g，側(cè)柏葉30 g，桑葉30 g、當(dāng)歸30 g等)外用方外洗患處。3個療程后患者頭部皮疹明顯變薄、松散，脫離大部分，現(xiàn)癥見頭部皮疹基本脫離，露出淡紅色基底皮膚，不癢，現(xiàn)繼以內(nèi)服方隨癥加減，外洗方同前繼續(xù)外用，以期后效。

6 討 論

銀屑病在皮膚科中是一種較為常見的慢性炎癥性，容易復(fù)發(fā)的皮膚病變[7～8]。銀屑病具有較長的演進(jìn)過程，病情易反復(fù)難愈[9]。明代醫(yī)家吳師機曰：“凡病多從外入，故醫(yī)有外治法，經(jīng)文內(nèi)取外取并列，未嘗教人專用內(nèi)治也?！彼J(rèn)為，內(nèi)、外治有殊途同歸之理，外治法之所以能治療內(nèi)疾，這是因為：“外治之理，即內(nèi)治之理，外治之藥，亦即內(nèi)治之藥。所異者，法耳!”其中熏法是中醫(yī)外科學(xué)中外治法的一種，這種方法是借藥物的熱氣蒸騰患處，依靠藥力和熱力直接接觸病變部位，直達(dá)病處，排出污濁毒邪，促使氣血流暢，血脈暢通，膜理開闔有度而諸癥消除?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，在皮膚表面或病變處直接用藥物熏洗，利用溫?zé)岷退幬锏淖饔?，刺激神?jīng)系統(tǒng)活躍，對心血管系統(tǒng)和周圍血管系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)整，能促進(jìn)血液循環(huán)及淋巴回流，能使水腫消退，腫痛減輕，也可加速新陳代謝，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。本次研究的主方“秦柏洗液”中單味藥對皮膚炎性的抑制作用顯著，而秦皮清熱解毒，燥濕止痢，在臨床上也有抑制皮膚瘙癢、抑制滅菌、抗腫瘤的作用[10～11]，現(xiàn)代藥理研究提示，當(dāng)歸含有揮發(fā)油和水溶性成分，具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗菌、抗炎作用，其中抗炎[12]作用主要是通過機體降低毛細(xì)血管通透性、抑制PGE2的合成或釋放、降低補體旁路的溶血活性。近來關(guān)于生側(cè)柏葉的研究眾多，該藥的藥用價值凸顯，而側(cè)柏葉味苦澀，有清香之味，微辛，有止咳、化痰、涼血、止血，烏須發(fā)的作用[13]，外用可療疥癬，散腫毒；《本草從新》描述生側(cè)柏“味苦微寒，性澀而燥。最清血分濕熱……祛風(fēng)濕諸痹，歷節(jié)風(fēng)痛……生肌殺蟲……汁，烏須發(fā)。丹溪以為補陰要藥……”現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，側(cè)柏葉中含有側(cè)柏總黃酮、揮發(fā)油等，具有抗炎、抗菌的作用[14]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，本研究中的化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)、靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中度值較大的靶點以及hub靶點共同構(gòu)成核心靶點，分別代表接受化合物刺激強度大、生物效應(yīng)廣、必要性及連通性強的靶點，代表了在自擬方“秦柏洗液”組成中單味藥在不同階段發(fā)揮作用的蛋白。從靶點及功能富集結(jié)果預(yù)測，秦柏洗液的藥理作用可能為調(diào)節(jié)機體免疫功能、改善皮膚表面的炎癥微環(huán)境、調(diào)節(jié)代謝、抗凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖等，為進(jìn)一步研究作用機制提供思路和方向。