陳曉雨，朱耀東，喻 鑫，劉 弋，于東風(fēng)

2018年全球范圍內(nèi)新增了100萬名胃癌患者，而且胃癌在惡性腫瘤中有著第五的發(fā)病率和第三的致死率，高致死率主要是晚期診斷所致[1]，為治愈帶來了巨大的困難，因此尋找胃癌新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點成為了當(dāng)今的熱點問題。富含亮氨酸的重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repetitive G protein-coupled receptor 5 , LGR5)是癌癥干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)腫瘤標(biāo)志物之一，在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[2],然而LGR5表達(dá)調(diào)控的潛在機制仍不明確。研究[3]表明胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島在不同基因啟動子區(qū)域的高(低)甲基化，可能是多種癌癥中腫瘤發(fā)生的主要原因。Su et al[3]發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌中LGR5啟動子的甲基化控制LGR5的表達(dá)影響腫瘤的進(jìn)展，該研究探討胃癌中是否存在類似的機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院高新院區(qū)開診半年內(nèi)的胃癌手術(shù)病例26份，胃癌確診依據(jù)該院病理科提供的術(shù)前術(shù)后病理報告。將26份病例納入隨訪，隨訪時間12個月。腫瘤分期采用TNM分期法。納入患者術(shù)前未接受新輔助放化療，也沒有合并其他惡性腫瘤。經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料和試劑新鮮胃癌組織、癌旁組織、正常組織；EZ DNA甲基化金試劑盒(美國加利福利亞ZYMO公司)；TIANGEN凝膠萃取裝備(北京TIANGEN公司)；10×反應(yīng)緩沖液及HotStartTaq聚合酶(大連TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.1提取基因組DNA 采用標(biāo)準(zhǔn)苯酚-氯仿萃取法，從胃癌、癌旁、正常組織中提取基因組DNA。

1.3.2亞硫酸鹽修飾 利用EZ DNA甲基化試劑盒對提取后的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，將基因組DNA未被甲基化修飾的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)。

1.3.3樣本目標(biāo)片段多重PCR反應(yīng) 以亞硫酸氫鹽處理過的DNA為模板，使用優(yōu)化后的多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物，以處理后的樣品基因組為模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。經(jīng)質(zhì)控后，將以同一個樣品基因組DNA為模板的所有多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物混合，并確保每個位點引物擴(kuò)增產(chǎn)物的量相當(dāng)。引物序列(5’-3’)F：GGTTTTYGGAGTAGTTTTGGTTGT，R：ATAAAACCRAACRAAAAATACCTAAAAA。

1.3.4樣本添加特異性標(biāo)簽序列 利用帶有Index序列的引物，通過PCR擴(kuò)增向文庫末端引入和Illumina平臺兼容的特異性標(biāo)簽序列。反應(yīng)采用11個循環(huán)數(shù)的PCR程序，盡可能降低PCR的傾向性。

1.3.5定量后上機測序 將所有樣品Index PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合，并經(jīng)割膠回收獲得最終的Methyl Target測序文庫，文庫的片段長度分布經(jīng)Agilent 2100 生物分析儀驗證。文庫摩爾濃度精確定量后，最終于IlluminaHiseq平臺，以2×150 bp的雙端測序模式進(jìn)行高通量測序，獲得數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況本次研究中共納入26份胃癌病例，其中男女比為9:4,腫瘤位于賁門胃底胃體部與幽門部的病例數(shù)基本相等，III～I(xiàn)V期患者占38.46%，分化好的胃癌僅占30.77%，癌胚抗原(CEA)陽性的患者也僅占26.92%，其中19.23%的患者1年內(nèi)發(fā)現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)。見表1。

2.2 LGR5在胃癌標(biāo)本不同位置的甲基化測定并計算胃癌組織、癌旁組織、正常組織擴(kuò)增子中不同位點LGR5啟動子CpG位點的甲基化水平(甲基化水平=該位點甲基化的reads數(shù)目/該位點總的reads數(shù)目)，結(jié)果每組胃癌組織中每個LGR5測量位點甲基化水平明顯降低，其中1例見圖1，測定位點數(shù)為15。另外以擴(kuò)增子為單位，分析胃癌組織、癌旁組織、正常組織中LGR5啟動子CpG位點的單倍型，結(jié)果亦得出每組胃癌組織中LGR5甲基化水平明顯降低。見圖2。注：單倍型類型，假設(shè)擴(kuò)增子序列(5’-3’)為：ATCATXGATCXGCTAXGCTTTAXG CCTAT，X可為c(甲基化修飾)或t(未甲基化修飾)，其中一條測序的read為：ATCATCGATCTGCTACGCTTTATGCCTAT，則該read對應(yīng)的擴(kuò)增子甲基化單倍型為：CTCT。

圖1 LGR5在不同組織中的甲基化水平

圖2 不同組織中LGR5啟動子CpG位點的單倍型

2.3 LGR5甲基化與胃癌臨床病理參數(shù)關(guān)系測定胃癌組織的LGR5啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平，LGR5的甲基化水平較高預(yù)示著病理分期早、浸潤深度淺、腫瘤小、無淋巴轉(zhuǎn)移、1年內(nèi)復(fù)發(fā)率低，見表1。

表1 LGR5甲基化與胃癌臨床病理參數(shù)關(guān)系

3 討論

癌癥起源于多種遺傳和表觀遺傳學(xué)變化的累積，受影響器官中的干細(xì)胞最有可能是癌癥的起源細(xì)胞，因為它們能夠自我更新并在多細(xì)胞分裂后長時間存活[4]。 CSC是一部分起源于未調(diào)控的干細(xì)胞或去分化的祖細(xì)胞并具有自我更新能力的細(xì)胞，同時擁有干細(xì)胞和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換特征[5]。一系列的證據(jù)表明CSC負(fù)責(zé)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、維持、侵襲、轉(zhuǎn)移、再生、耐藥[3]，對于胃癌干細(xì)胞現(xiàn)已證實的標(biāo)記物有分化抗體群(cluster of differentiation,CD)44、CD24、CD133、LGR5、結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4、上皮細(xì)胞粘附分子、乙醛脫氫酶1等[2]。

先前有研究[6-7]表明，LGR5在胃癌中表達(dá)增高，并與TNM分期與淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為胃癌侵襲、預(yù)后、抗幽門螺桿菌治療療效評估的指標(biāo)。LGR5+細(xì)胞是胃癌的起源細(xì)胞，胃主細(xì)胞表達(dá)LGR5，并定植在腺體基底部，可作為上皮損傷后的儲備干細(xì)胞[4]。LGR5可激活WNT/β-連環(huán)蛋白通路，β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞核中積累，調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，影響胃癌的發(fā)生發(fā)展[8]。目前針對結(jié)直腸癌以及卵巢上皮癌的研究得出LGR5啟動子CpG島甲基化程度與腫瘤的發(fā)生、相關(guān)病理參數(shù)、良好的預(yù)后負(fù)相關(guān)[4,9]。在此，該文探究LGR5啟動子CpG島甲基化水平在胃癌中是否有相似的關(guān)系。

目前測定DNA甲基化仍多通過傳統(tǒng)方法，如甲基化特異PCR和亞硫酸氫鹽測序法的方法實現(xiàn)，通量小，且無法準(zhǔn)確計算位點/區(qū)域的甲基化水平。該研究利用多重PCR和Methyl Target技術(shù)，實現(xiàn)對多個特定CpG島同時捕獲測序，并憑借高深度測序數(shù)據(jù)，能夠準(zhǔn)確計算每個CpG位點的甲基化水平，準(zhǔn)確性高，靈活性強。通過對26組標(biāo)本進(jìn)行測序并與相關(guān)臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計分析，得出LGR5的甲基化水平與胃癌病理分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、1年內(nèi)復(fù)發(fā)呈負(fù)相關(guān)。以此推斷LGR5啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平下降導(dǎo)致LGR5表達(dá)增強，下調(diào)了CSC的分化、促進(jìn)了胃癌的生長、轉(zhuǎn)移、再生。與以往關(guān)于LGR5在胃癌CSC表達(dá)的研究結(jié)果[7，10-11]基本一致。既往研究[10]表明分化較差、彌漫性、腸型及有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中LGR5表達(dá)較高，與該研究的結(jié)果不相符，可能是納入樣本量較少，造成了偏倚。并且在臨床中有部分IV期患者放棄手術(shù)治療，也可能導(dǎo)致了誤差。另外，臨床上認(rèn)為CEA對于胃癌的診斷并沒有特異性，僅作為判斷預(yù)后和治療效果的參考指標(biāo)，而該研究結(jié)果亦顯示LGR5啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平與患者血清CEA水平并沒有表現(xiàn)出相關(guān)性。

上文提到LGR5與WNT/β-連環(huán)蛋白通路密切相關(guān)，在胃癌中WNT信號通路的活動水平增強[7]，結(jié)合該研究結(jié)果，可能是LGR5啟動子甲基化水平降低所致。LGR5的表達(dá)與胃癌血管形成正相關(guān)，與表達(dá)在小鼠胚胎的腫瘤壞死因子受體超家族成員負(fù)相關(guān)，與“叉頭”蛋白O1負(fù)相關(guān)，與“刺猬”基因/鋅子轉(zhuǎn)錄因子2信號通路負(fù)相關(guān)，與鋅指蛋白3負(fù)相關(guān)，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白正相關(guān)，與R-脊椎蛋白正相關(guān)，與雙腎上腺皮質(zhì)激素樣激酶1正相關(guān)，與重組人Nanog同源框假基因8正相關(guān)，與Notch信號通路正相關(guān)[5,7,9-12]。但這些因子或信號通路與LGR5甲基化的關(guān)系還未闡明，具有較好的研究前景。然而，DNA甲基化并不是調(diào)節(jié)CSC的唯一分子機制，組蛋白修飾、mircoRNA、染色質(zhì)重塑等也可能在癌變中發(fā)揮作用[3]。

抗LGR5抗體綴合物及一些中藥如胃痞消與胃癌組織中LGR5的表達(dá)存在一定的相關(guān)性[13-14]。需要進(jìn)一步研究這些藥物及新的藥物與LGR5甲基化的關(guān)系，為臨床藥物治療及新藥上市提供依據(jù)。

綜上，胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，該研究用定量的方法計算出LGR5在胃癌組織中的甲基化水平明顯降低，而且LGR5的甲基化水平與胃癌病理分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移、1年內(nèi)復(fù)發(fā)相關(guān)。但是本次結(jié)果需要更大的樣本量進(jìn)一步證實，而且與WNT/β-連環(huán)蛋白通路及其它相關(guān)因子的關(guān)系還有待探究，以此為胃癌的治療提供依據(jù)及新的方向。