吳 震，朱文祥，劉洪茂，穆柯瀚，姬艷麗

近年來(lái)，關(guān)于高溫與男性生殖健康之間的關(guān)系日益受到生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普遍關(guān)注。一些研究[1]已證實(shí)精子的發(fā)生、男性不育與陰囊溫度有關(guān)。課題組前期研究[2-3]也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理(43 ℃、15 min)后能夠明顯引起小鼠睪丸組織病理學(xué)損傷，誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞凋亡，但目前熱處理誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制仍不清楚。

鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是多種組織類型中廣泛分布的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一個(gè)重要構(gòu)成部分。研究[4]表明，CaMKⅡ在激活狀態(tài)下與細(xì)胞凋亡有著密切聯(lián)系?，F(xiàn)主要研究陰囊短暫、輕度熱應(yīng)激對(duì)睪丸CaMKⅡ表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討CaMKⅡ在急性熱應(yīng)激誘導(dǎo)睪丸損傷中的作用及闡明熱應(yīng)激對(duì)男性生殖損傷的機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康清潔級(jí)ICR小鼠(6～8周齡，♂，28～35 g)，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，小鼠飼養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室溫度為20～25 ℃、濕度為(50±5)%、晝夜各12 h的動(dòng)物房?jī)?nèi)。實(shí)驗(yàn)期間，小鼠自由攝食和飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(皖)2011-002。實(shí)驗(yàn)研究符合《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的要求和規(guī)定。

1.2 化學(xué)試劑RT和PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自北京博奧森科技有限公司；磷酸化鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(phosphor-calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，p-CaMKⅡ)、ERK1/2、p-ERK1/2 抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；其他生化試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 動(dòng)物處理按照參考文獻(xiàn)[2]的處理方式，對(duì)小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激處理。將24只成年ICR雄性小鼠隨機(jī)分為4組(每組6只，分別為對(duì)照組、熱應(yīng)激0.5 h組、熱應(yīng)激2 h組和熱應(yīng)激6 h組)。將熱處理組小鼠身體下1/3部位置于43 ℃恒溫水浴中15 min，在熱處理后0.5、2、6 h后進(jìn)行剖殺。將對(duì)照組小鼠身體下1/3部位置于22 ℃恒溫水浴中15 min，于6 h后剖殺取睪丸組織。采用Western blot技術(shù)分析各組睪丸p-CaMKⅡ、p-ERK1/2、 ERK1/2、β-actin蛋白表達(dá)水平。將對(duì)照組、熱應(yīng)激2 h組和熱應(yīng)激6 h組睪丸進(jìn)行HE染色，采用免疫組織化學(xué)方法觀察p-CaMKⅡ 蛋白的表達(dá)水平。

1.4 睪丸組織切片取對(duì)照組、熱應(yīng)激2 h組和熱應(yīng)激6 h組一側(cè)完整包膜未破損的睪丸，置于4%MDF(含有30%甲醛、15%乙醇、5%冰乙酸和50%三蒸水)固定24 h，然后經(jīng)無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續(xù)切片、HE染色、光學(xué)樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸組織病理學(xué)變化并拍照。

1.5 TUNEL每組選取睪丸石蠟切片各3張，按照參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行TUNEL及酶標(biāo)記反應(yīng)，DAB顯色處理后采用蘇木素復(fù)染，于光鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.6Westernblot按照參考文獻(xiàn)[2]進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，采用5% 脫脂牛奶溫封閉后的PVDF膜分別用一抗[β-actin(1 ∶2 000)、p-CaMKⅡ(1 ∶2 000) 、ERK1/2(1 ∶5 000)、p-ERK1/2(1 ∶5 000)]4 ℃孵育過(guò)夜，之后用抗小鼠或抗兔IgG(β-actin：1 ∶40 000、p-CaMKⅡ：1 ∶40 000 、ERK1/2：1 ∶40 000、p-ERK1/2：1 ∶40 000)于搖床上室溫孵育1.5 h，采用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)各組蛋白的表達(dá)。Western blot結(jié)果分析：采用tanon4.2凝膠成像系統(tǒng)將目的蛋白的表達(dá)水平用內(nèi)參β-actin標(biāo)化，將對(duì)照組標(biāo)化后的比值定為1。

1.7 免疫組織化學(xué)檢測(cè)p-CaMKⅡ表達(dá)應(yīng)用免疫組化PV-6000通用二步法檢測(cè)睪丸中p-CaMKⅡ的表達(dá)情況。檢測(cè)修復(fù)抗原、血清封閉后的睪丸病理切片采用一抗p-CaMKⅡ 4 ℃孵育過(guò)夜，之后采用相應(yīng)二抗處理、DAB顯色、蘇木素復(fù)染。在顯微鏡下觀察p-CaMKⅡ的分布及表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 熱應(yīng)激對(duì)睪丸組織病理的影響單次、短暫、輕度陰囊熱應(yīng)激所誘導(dǎo)的睪丸損傷非常顯著，熱應(yīng)激處理2 h后小鼠睪丸生殖細(xì)胞細(xì)胞核固縮，并在熱應(yīng)激處理6 h后病理改變加重，表現(xiàn)為小鼠睪丸生精小管間隙增大，生精小管內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，胞漿空泡化顯著,發(fā)生細(xì)胞核固縮的細(xì)胞增多(圖1B、1C)。陰囊熱應(yīng)激能夠明顯誘導(dǎo)小鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡，其中主要表現(xiàn)為精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞的凋亡(圖2B、2C)。

2.2 熱應(yīng)激對(duì)p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響采用免疫組化PV-6000通用二步法技術(shù)分析睪丸p-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激后2 h、6 h組睪丸中p-CaMKⅡ(T286)蛋白的表達(dá)水平均顯著升高。Western blot研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激處理能夠明顯增加睪丸CaMKⅡ 蛋白的磷酸化(F=22.21,P<0.05)(圖3)，與免疫組化結(jié)果相一致(圖4)。

圖1 熱應(yīng)激對(duì)睪丸病理的影響 HE染色×200A：對(duì)照組；B：熱應(yīng)激2 h組；C：熱應(yīng)激6 h組

圖2 熱應(yīng)激對(duì)睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響 DAB染色×200A：對(duì)照組；B：熱應(yīng)激2 h組；C：熱應(yīng)激6 h組

圖3 熱應(yīng)激對(duì)睪丸p-CaMKⅡ蛋白表達(dá)的影響

1：對(duì)照組；2：熱應(yīng)激0.5 h組；3：熱應(yīng)激2 h組4：熱應(yīng)激6 h組；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與熱應(yīng)激2 h組比較：#P<0.05

圖4 熱應(yīng)激對(duì)睪丸p-CaMKⅡ的分布表達(dá)的影響PV二步法×100

A：對(duì)照組；B：熱應(yīng)激2 h組；C：熱應(yīng)激6 h組

2.3 熱應(yīng)激對(duì)p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)存在于睪丸支持細(xì)胞及各級(jí)生精細(xì)胞中，對(duì)精子發(fā)生與成熟具有重要作用。本研究表明，熱應(yīng)激能夠激活ERK，表現(xiàn)為熱應(yīng)激組小鼠睪丸組織p-ERK1/2蛋白(Thr202/Tyr204)的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=29.06,P<0.01)(圖5)。

3 討論

睪丸具有高度增殖能力，對(duì)溫度特別敏感，較高的陰囊溫度會(huì)損害精子發(fā)生。陰囊過(guò)熱引起的睪丸生殖細(xì)胞凋亡是男(雄)性不育的主要原因之一。研究證明，單次熱處理能引起睪丸組織發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[5-6]，熱應(yīng)激主要通過(guò)線粒體信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸生殖細(xì)胞凋亡[7]，而CaMKⅡ蛋白在線粒體信號(hào)通路引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于CaMKⅡ蛋白在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的睪丸生殖細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用尚不清楚。

圖5 熱應(yīng)激對(duì)睪丸p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

1：對(duì)照組；2：熱應(yīng)激0.5 h組；3：熱應(yīng)激2 h組4：熱應(yīng)激6 h組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

CaMKⅡ具有四種亞型(α、β、δ和γ)，其中α亞基主要分布在前腦，與記憶功能有關(guān)[8]，β亞基具有維持突觸正常的結(jié)構(gòu)和功能的作用[9]，δ亞基主要存在于心臟中，與相關(guān)心臟疾病有關(guān)[10]。CaMKⅡ在睪丸中主要存在于早期精母細(xì)胞的生精小管最外層[11]。在靜息條件下，CaMKⅡ保持在非活性狀態(tài)，在應(yīng)激狀態(tài)下，通過(guò)影響下游受體進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。一旦激活，CaMKⅡ即使在沒(méi)有Ca2+/CaM結(jié)合的情況下，也可通過(guò)蘇氨酸287的自磷酸化維持激活狀態(tài)[12]。

相關(guān)文獻(xiàn)[13]表明，抑制CaM和CaMKⅡ可降低線粒體信號(hào)通路相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，提示CaMKⅡ可能通過(guò)線粒體通路引起細(xì)胞凋亡。此外，有研究[14]表明抑制CaMKⅡ能夠緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化損傷，提高線粒體的完整性和膜電位。CaMKⅡ阻斷劑KN93、AIP均能夠減弱毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時(shí)還能夠抑制ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，提示CaMKⅡ在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞死亡中具有重要作用[15]。本課題研究結(jié)果也表明，與對(duì)照組相比，熱應(yīng)激處理能顯著誘導(dǎo)小鼠睪丸中p-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)。提示p-CaMKⅡ在輕度熱應(yīng)激引起的小鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。對(duì)小鼠進(jìn)行熱應(yīng)激處理后，可通過(guò)誘導(dǎo)小鼠睪丸中p-CaMKⅡ蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)小鼠睪丸組織造成病理?yè)p傷，造成小鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡的發(fā)生。對(duì)于陰囊溫度對(duì)雄性生殖健康影響的研究具有一定意義。

CaMKⅡ不僅是一個(gè)CaM效應(yīng)器，而且能夠感知、整合和傳導(dǎo)細(xì)胞Ca2+和Ca2+-CaM信號(hào)。一些病理狀態(tài)下如腫瘤轉(zhuǎn)移、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和男性不孕，Ras-ERK信號(hào)通路被激活，同樣也能夠檢測(cè)到CaMKⅡ的改變，CaMKⅡ的過(guò)度表達(dá)可增強(qiáng)肌漿網(wǎng)Ca2+的釋放，也增強(qiáng)了線粒體Ca2+的攝取，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究也發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激能顯著誘導(dǎo)小鼠睪丸中p-ERK1/2蛋白的表達(dá)，提示CaMKⅡ可能通過(guò)CaM-CaMKⅡ和ERK1/2信號(hào)通路導(dǎo)致線粒體的功能障礙，并進(jìn)一步導(dǎo)致生殖細(xì)胞凋亡。