張 靜，彭靖淇，吳秀娟，普雄明

卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma，KS)是內(nèi)皮細(xì)胞起源的惡性腫瘤[1]。卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV)屬于γ2皰疹病毒[2]，是KS最重要的病原體。KSHV主要通過編碼miRNAs在KS中發(fā)揮作用[3]。miRNAs是非編碼小分子RNA[4]。miRNAs通過結(jié)合靶基因3′UTR區(qū)下調(diào)或沉默靶基因的表達(dá)[5]。miRNAs調(diào)控超過1/3的人類基因[6]，通過復(fù)雜的機(jī)制在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用, 廣泛參與腫瘤的形成和發(fā)展[7-8]。Wu et al[9]研究顯示 :13個(gè)KSHV miRNAs在KS中表達(dá)全部上調(diào)，其中kshv-mir-k12-1-5p上調(diào)最高，KSHV miRNAs主要通過調(diào)控或改變細(xì)胞周期導(dǎo)致KS的發(fā)生[10]，故推測(cè)kshv-mir-k12-1-5p可能與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1A(CDKN1A)是功能強(qiáng)大的細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控因子。miRNAs通過抑制靶基因的翻譯而發(fā)揮其生物學(xué)功能[11]?，F(xiàn)研究kshv-mir-k12-1-5p對(duì)靶基因(CDKN1A)的抑制作用及對(duì)KS細(xì)胞周期的影響，為KS的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑卡波西肉瘤細(xì)胞株(KS cell line, SLK)(美國(guó)NIH AIDS Research and Reagent Program提供); 293T cells(美國(guó)Open Biosystems公司)；雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；Lipofectamine 2000、TRIzol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)；kshv-mir-k12-1-5p 模擬物(mimics)、kshv-mir-k12-1-5p抑制物(inhibitor)、mimics陰性對(duì)照(NC)、inhibitor NC(上海吉瑪技術(shù)有限公司)；RIPA裂解液、細(xì)胞周期分析試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；CDKN1A、GAPDH、HRP(美國(guó)Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度為80%的SLK細(xì)胞(KS細(xì)胞)。將SLK細(xì)胞按每孔2×105細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h。Western blot、qRT-PCR及細(xì)胞周期PI實(shí)驗(yàn)均分5組進(jìn)行：mimics組、inhibitor組、mimics NC組、inhibitor NC組、正常細(xì)胞組(normal cell group)。使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將實(shí)驗(yàn)5組分別轉(zhuǎn)染到SLK中，轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h。

1.2.2雙熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將野生型(WT)和突變型(MUT) CDKN1A 3′UTR擴(kuò)增并構(gòu)建為pYr-mirTarget重組質(zhì)粒。然后用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒(1 μg)和kshv-mir-k12-1-5p mimics、mimics NC(50 nmol/L) 共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(5×104)。轉(zhuǎn)染24 h后，使用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶相對(duì)活性。

1.2.3Western blot(WB)檢測(cè) 使用400 μl RIPA裂解液(50 mmol/L Tris/pH7.4、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、sodium orthova-nadate、sodium fluoride、EDTA、leupeptin)提取細(xì)胞總蛋白。根據(jù)蛋白質(zhì)含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備層疊凝膠(5%)和分離凝膠(12%)。然后進(jìn)行電泳(1.5 h、100 V)。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠板底部時(shí)，電泳結(jié)束。將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，整個(gè)過程持續(xù)70 min，用脫脂奶粉(5%)阻斷膜2 h。一抗CDKN1A稀釋(1 ∶1 000)、GAPDH稀釋(1 ∶1 000)在4 ℃下孵育過夜。HRP二抗稀釋(1 ∶10 000)在37 ℃下孵育2 h、使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光成像。利用BandScan進(jìn)行灰度值分析。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè) 使用1 ml TRIzol提取細(xì)胞總RNA。用 miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒檢測(cè)mRNA和miRNA的表達(dá)水平。大約3 μg的總RNA用于互補(bǔ)DNA(cDNA)的合成。使用2 μl的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s ; 95 ℃ 5 s , 60 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán); 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，運(yùn)用2-ΔΔCt相對(duì)定量法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。CDKN1A引物(F：5′-CCCGTGAGCGATGGAACTT-3′；R：5′CGAGGCACAAGGGTACAAGAC-3′)；以GADPH作為對(duì)照 (F：5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′；R：5′-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′)；kshv-mir-k12-1-5p引物(F：5′-TGCGCATTACAGG AAACTGGGTG-3′； R：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAG GTATT-3′；莖-環(huán)結(jié)構(gòu)引物(stem-loop)：5′-GTCG TATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA CGACGCTTACAC-3′)。以U6作為對(duì)照(F：5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′；R：5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′)。

1.2.5細(xì)胞周期(PI法)測(cè)定 將kshv-mir-k12-1-5p mimics、inhibitor等(50 nmol/L)分別轉(zhuǎn)染到SLK細(xì)胞中。48 h后獲得2×105個(gè)細(xì)胞。用200 μl的細(xì)胞液離心5 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次。隨后，細(xì)胞在-20 ℃下用75%乙醇固定1 h，在4 ℃下預(yù)冷。用冷PBS再次清洗細(xì)胞。細(xì)胞周期分析試劑盒的使用方法參照生產(chǎn)廠家提供的說明書，將Rnase A溶液(20 μl)加入細(xì)胞，37 ℃下置于水浴中30 min，然后將PI染料溶液(400 μl)加入混合物中，4 ℃下在黑暗中孵育。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)488 nm。(PI值=S+G2/G1+S+G2，其中PI為增殖活性指數(shù)。PI值越大，細(xì)胞周期進(jìn)程越快，細(xì)胞周期時(shí)間越短，細(xì)胞增殖越快。)

2 結(jié)果

2.1 kshv-mir-k12-1-5p的轉(zhuǎn)染水平將kshv-mir-k12-1-5p mimics、 inhibitor等分別轉(zhuǎn)染到SLK細(xì)胞中，qRT-PCR結(jié)果顯示，mimics組kshv-mir-k12-1-5p轉(zhuǎn)染水平最高(4.43±0.07), inhibitor組kshv-mir-k12-1-5p轉(zhuǎn)染水平最低(0.72±0.02)。各組轉(zhuǎn)染水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 971.42，P<0.01)，見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)kshv-mir-k12-1-5p的轉(zhuǎn)染水平

1：normal cell group; 2：mimics 組; 3：inhibitor組；4:mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與 mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

2.2 CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-K12-1-5p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過Mirbase(http://www.mirbase.org/)靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，從數(shù)百個(gè)靶基因中選擇CDKN1A作為kshv-mir-K12-1-5p的靶基因驗(yàn)證，因?yàn)镃DKN1A與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)，是功能強(qiáng)大的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子。圖2顯示了CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-K12-1-5p的種子區(qū)序列(Seed sequence)的結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 kshv-mir-k12-1-5p特異靶向CDKN1A293T細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染kshv-mir-k12-1-5p mimics+CDKN1A-WT、mimics NC+CDKN1A-WT、kshv-mir-k12-1-5p mimics+CDKN1A-MUT和mimics NC+ CDKN1A-MUT。24 h后測(cè)定熒光素酶的相對(duì)活性。kshv-mir-k12-1-5p mimics和CDKN1A-WT共轉(zhuǎn)染后，相對(duì)熒光素酶活性降低(4.56±0.18)；kshv-mir-k12-1-5p mimics和CDKN1A-MUT共轉(zhuǎn)染后，相對(duì)熒光素酶活性無明顯變化(7.11±0.17)。 mimics NC和CDKN1A-WT/ CDKN1A-MUT轉(zhuǎn)染后相對(duì)熒光素酶活性無明顯影響[(6.29±0.19)vs(7.04±0.21)]。各組熒光素酶的相對(duì)活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.31，P<0.01)。因此，CDKN1A是kshv-mir-k12-1-5p直接作用的靶基因。見圖3。

圖2 CDKN1A 3′UTR與kshv-mir-k12-1-5p的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 各組相對(duì)熒光素酶活性

1：mimics+CDKN1A-WT組；2：mimics NC+CDKN1A-WT組；3：mimics+CDKN1A-MUT組；4：mimics NC+CDKN1A-MUT組；與mimics+CDKN1A-WT組比較：**P<0.01

2.4 kshv-mir-k12-1-5p負(fù)性調(diào)控靶基因CDKN1A的表達(dá)轉(zhuǎn)染kshv-mir-k12-1-5p mimics后，SLK細(xì)胞中CDKN1A的蛋白表達(dá)水平顯著低于其余4組；轉(zhuǎn)染kshv-mir-k12-1-5p inhibitor后，SLK細(xì)胞中CDKN1A的蛋白表達(dá)水平顯著高于其余4組；轉(zhuǎn)染kshv-mir-k12-1-5p mimics后，SLK細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)水平顯著低于其余4組；轉(zhuǎn)染kshv-mir-k12-1-5p inhibitor后，SLK細(xì)胞中CDKN1A mRNA的表達(dá)水平顯著高于其余4組。各組CDKN1A的蛋白水平(F=76.10，P<0.01)和mRNA表達(dá)水平(F=83.31，P<0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，kshv-mir-k12-1-5p可以負(fù)調(diào)控靶基因CDKN1A的表達(dá)。見圖4。

2.5 kshv-mir-k12-1-5P對(duì)SLK細(xì)胞周期的影響轉(zhuǎn)染SLK細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。結(jié)果顯示:與其余4組比較，kshv-mir-k12-1-5p mimics組PI值最高，G1期細(xì)胞數(shù)量最少，S+G2期細(xì)胞數(shù)量最多；與其余4組比較，kshv-mir-k12-1-5p inhibitor組PI值最低、G1期細(xì)胞數(shù)量最多、S+G2期細(xì)胞數(shù)量最少。各組PI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=220.01，P<0.01)。因此，kshv-mir-k12-1-5P可加速細(xì)胞周期進(jìn)程，縮短細(xì)胞周期時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞增殖，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換。見圖5。

圖4 kshv-mir-k12-1-5p負(fù)性調(diào)控靶基因CDKN1A的表達(dá)

A：Western blot法檢測(cè)結(jié)果圖；B：CDKN1A蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：CDKN1A mRNA 相對(duì)表達(dá)量；1：normal cell group; 2：mimics組; 3：inhibitor組；4:mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

3 討論

卡波西肉瘤是間葉源性高度播散的血管肉瘤[1]。其在中國(guó)新疆高發(fā)，主要見于維吾爾族和哈薩克族。KS與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、KSHV、血管生成細(xì)胞分化和遺傳易感性有關(guān)。KSHV是導(dǎo)致人類惡性腫瘤的七種病毒之一,可引起人類宿主終身感染，是KS的重要致病因子。KSHV主要通過編碼的miRNAs發(fā)揮作用，KSHV miRNAs對(duì)宿主細(xì)胞的周期及自身周期均有重要的調(diào)控作用，最終可以誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生[10]。

Catrina Ene et al[12]通過基因芯片分析了17例KS樣本與3例正常皮膚樣本中miRNAs的表達(dá)差異，結(jié)果顯示：kshv-mir-k12-4-3p、kshv-mir-k12-1在KS中表達(dá)明顯上調(diào)，Wu et al[9]通過KS及瘤旁組織中miRNAs表達(dá)差異譜分析得出：69個(gè)miRNAs在KS中表達(dá)明顯上調(diào)，101個(gè)miRNAs表達(dá)明顯下調(diào)。其中kshv-mir-k12-1-5p表達(dá)上調(diào)最為明顯。因此高表達(dá)的kshv-mir-k12-1-5p可能與KS的細(xì)胞調(diào)控密切相關(guān)，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。miRNAs 的功能研究關(guān)鍵在于其靶基因的確定。因?yàn)閙iRNAs通過抑制靶基因的功能來發(fā)揮生物學(xué)作用[11]。如KSHV感染的淋巴瘤細(xì)胞中KSHV miRNA調(diào)控的潛在靶基因在該病的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用[13]。

圖5 kshv-mir-k12-1-5P對(duì)SLK細(xì)胞周期的影響

A：細(xì)胞周期分布；B：細(xì)胞周期PI值(%)；1：normal cell group; 2：mimics組; 3：inhibitor組；4：mimics NC組; 5: inhibitor NC組; 與 mimics NC組比較：**P<0.01；與inhibitor NC組比較：##P<0.01

CDKN1A是細(xì)胞周期相關(guān)基因，位于6號(hào)染色體上。作為一種抑癌基因，在腫瘤中廣泛低表達(dá)。細(xì)胞周期有兩個(gè)重要的檢查點(diǎn)：G1/S期和G2/M期。從細(xì)胞周期進(jìn)程來看，G1/S期的檢查點(diǎn)調(diào)控比G2/M期更為重要。CDKN1A主要作用于G1/S期檢查點(diǎn)[14]，抑制G1期向S期進(jìn)展。與P53間接作用細(xì)胞周期不同，CDKN1A直接與 Cyclin / CDK復(fù)合蛋白或CDK蛋白激酶結(jié)合，負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期。當(dāng)受到化學(xué)或物理刺激時(shí)，CDKN1A可以修復(fù)損傷的DNA，如果CDKN1A受到抑制，細(xì)胞沒有完全修復(fù)直接進(jìn)入細(xì)胞周期，復(fù)制錯(cuò)誤遺傳信息，將導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[15]。

本研究通過檢測(cè)熒光素酶表達(dá)活性確定了kshv-mir-k12-1-5p可特異性地作用于CDKN1A-3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)，CDKN1A是kshv-mir-k12-1-5p作用的靶基因。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): kshv-mir-k12-1-5p表達(dá)上調(diào)時(shí)，SLK細(xì)胞中CDKN1A 的蛋白和mRNA表達(dá)水平均明顯下降；kshv-mir-k12-1-5p表達(dá)下調(diào)時(shí)，CDKN1A 的蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯升高，可見kshv-mir-k12-1-5p能負(fù)性調(diào)控 CDKN1A的表達(dá)。此外，本研究應(yīng)用細(xì)胞周期PI法分析kshv-mir-k12-1-5p對(duì)KS細(xì)胞周期的影響，結(jié)果表明：kshv-mir-k12-1-5p過表達(dá)后KS細(xì)胞的G1期細(xì)胞數(shù)量明顯減少，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯增加;抑制kshv-mir-k12-1-5p表達(dá)后，KS細(xì)胞發(fā)生G1期細(xì)胞阻滯，S期和G2期細(xì)胞數(shù)量明顯減少。因此kshv-mir-k12-1-5p可以促進(jìn)KS細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞周期的進(jìn)程。下一步本課題組將進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確 kshv-mir-k12-1-5p和靶基因共同參與KS發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，為KS的治療提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

綜上，kshv-mir-k12-1-5p可能通過下調(diào)或沉默靶基因CDKN1A的表達(dá)發(fā)揮細(xì)胞周期調(diào)控作用。它具有促癌基因的功能，正性調(diào)控KS的細(xì)胞周期，縮短細(xì)胞周期時(shí)間，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)換。導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，誘導(dǎo)KS的發(fā)生。而抑制kshv-mir-k12-1-5p的表達(dá)有可能成為KS的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。