周 青，魏 翔，張素梅，汪 淵

目前世界每年新增加的癌癥患者約1 808萬，死亡約956萬[1]，在未來相當(dāng)長的時間癌癥仍將是人類面臨的一項嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步人們對癌癥的本質(zhì)有了深入的了解，腫瘤的治療也由傳統(tǒng)的手術(shù)、放療和化療發(fā)展到多學(xué)科聯(lián)合治療，并出現(xiàn)了誘導(dǎo)分化治療。誘導(dǎo)分化治療是指誘導(dǎo)分化劑作用于腫瘤細(xì)胞后腫瘤細(xì)胞重新向正常細(xì)胞分化，生物學(xué)特性逐漸向正常細(xì)胞靠攏，甚至轉(zhuǎn)變成正常細(xì)胞的現(xiàn)象。維甲酸類化合物是典型的誘導(dǎo)分化劑且在臨床廣泛使用，它包括全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)、3,4-雙脫氫維甲酸(ddRA)、9-順維甲酸(9-cis-RA)和13-順維甲酸(13-cis-RA)等[2]。研究[3]表明ATRA對多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)分化、抑制增殖并促進(jìn)凋亡的作用，本文主要研究ATRA作為體外誘導(dǎo)分化劑對人肝癌細(xì)胞株HepG2在分化、凋亡、遷移和克隆形成等細(xì)胞生物學(xué)行為方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人肝癌細(xì)胞株HepG2(安徽醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)實驗室保存)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Clark公司)；ATRA和MTT試劑(美國Sigma公司)；細(xì)胞凋亡Hoechst 33258試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(上海碧云天公司)；γ-GT、AFP檢測試劑盒(上海復(fù)興長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司)等。

1.2 主要實驗儀器二氧化碳培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機和酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公司)；熒光顯微鏡DM400B和倒置顯微鏡DMI3000B(德國Leica公司)；超聲破碎儀(寧波新芝公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1細(xì)胞的復(fù)蘇和培養(yǎng) 將保存的HepG2細(xì)胞從液氮中取出，37 ℃水浴融化，加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，混勻。置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d傳代后使用。

1.3.2細(xì)胞形態(tài)的觀察和AFP、γ-GT比活性的檢測 將HepG2細(xì)胞分為對照組(含0.1%的DMSO)和ATRA加藥組(ATRA溶解于DMSO中，ATRA終濃度分別為1 μmol/L和10 μmol/L)，預(yù)實驗表明0.1%DMSO對細(xì)胞生長沒有影響。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3遍，胰酶消化，DMEM完全培養(yǎng)基終止消化，計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為6×103個/ml，細(xì)胞按2、5、14、42、72 d時間培養(yǎng)，2、5 d加藥組直接在24孔板中培養(yǎng)，14、42、72 d加藥組先在培養(yǎng)瓶中加藥培養(yǎng)，3 d傳代1次，最后5 d移至24孔板中培養(yǎng)(調(diào)整細(xì)胞密度為6×103個/ml)。到達(dá)預(yù)定培養(yǎng)時間后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化并拍照；收集對照組和加藥組細(xì)胞，離心取上清液檢測AFP含量；將細(xì)胞沉淀用PBS洗滌3次，加入含0.5%Triton X-100的Tris-HCl緩沖液，超聲破碎，4 ℃高速離心15 min(15 000 r/min)，取上清液用BCA法蛋白定量后檢測γ-GT比活性。

1.3.3細(xì)胞增殖實驗 細(xì)胞分組、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間同上；取200 μl細(xì)胞密度為5×103個/ml的DMEM完全培養(yǎng)基加入96孔板中，每組6個復(fù)孔，在到達(dá)培養(yǎng)時間時，每孔加入10 μl MTT(5 g/L)，置37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡孔中培養(yǎng)基, 每孔加入100 μl DMSO，酶標(biāo)儀檢測對照組和加藥組吸光度A，細(xì)胞抑制率%=(細(xì)胞對照組OD570-加藥處理組OD570)/細(xì)胞對照組OD570×100%，重復(fù)3次，計算各組細(xì)胞抑制率。

1.3.4細(xì)胞凋亡實驗 將硅化蓋玻片放入清潔液中浸泡，流水沖洗，再用去離子水沖洗，高壓滅菌后置于70%乙醇中浸泡，使用時超凈臺中吹干放入24孔板中，種入細(xì)胞；細(xì)胞分組、培養(yǎng)方法和培養(yǎng)時間同上，各組細(xì)胞在密度達(dá)到50%～60%時取出蓋玻片放在載玻片上固定并Hoechst染色。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)(激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm)，細(xì)胞核致密濃染為凋亡細(xì)胞。每一組細(xì)胞隨機拍攝3個視野，細(xì)胞計數(shù)。重復(fù)3次，計算細(xì)胞凋亡率，凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.5細(xì)胞遷移實驗 取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后接種至24孔板中。待細(xì)胞全部長滿24孔板底部，用200 μl塑料吸頭在24孔板每孔中央劃出一條直線劃痕，洗去脫落細(xì)胞，在顯微鏡下拍照作為0 h，對照組和加藥組培養(yǎng)至24、48、72 h時，分別在同一觀察點拍照記錄細(xì)胞劃痕處的細(xì)胞遷移情況，重復(fù)3次。利用Quantity One軟件測量各孔多點劃痕距離取均值，細(xì)胞遷移距離為0 h的距離減去24、48、72 h處理后的距離。

1.3.6細(xì)胞軟瓊脂克隆實驗 首先在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中鋪設(shè)0.6%瓊脂(每孔3 ml)，冷卻凝固作為底層瓊脂；取處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液并稀釋到終濃度為1×103個/ml；鋪設(shè)0.3%上層軟瓊脂，按1 ∶1比例吸取2×DMEM培養(yǎng)基，加入0.6%軟瓊脂(70 ℃)，迅速混勻再加入細(xì)胞懸液(細(xì)胞終濃度5×102個/ml)，輕輕混勻，按每孔1.0 ml加入6孔板中，6孔板置于濕盒中室溫放置30 min，再連同濕盒一起置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在到達(dá)各培養(yǎng)時間時每孔加入MTT染液1 ml，30 min后觀察對照組和加藥組細(xì)胞克隆的形成狀態(tài)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 ATRA對HepG2細(xì)胞分化的影響

2.1.1HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化 倒置顯微鏡下觀察到HepG2對照組細(xì)胞成簇狀生長，細(xì)胞密度大，具有良好的光澤度，細(xì)胞形態(tài)不因培養(yǎng)時間不同而發(fā)生變化(圖1)。1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細(xì)胞在第5天時可見細(xì)胞數(shù)目減少且細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則并呈離散狀生長，72 d時細(xì)胞形態(tài)更為細(xì)長，多核細(xì)胞更少；同一處理時間段10 μmol/L ATRA組細(xì)胞形態(tài)變化比1 μmol/L ATRA組更加明顯。

2.1.2ATRA對HepG2細(xì)胞γ-GT比活性和AFP分泌量的影響 與對照組相比，同一處理天數(shù)，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細(xì)胞γ-GT比活性均呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組AFP分泌量也呈下降趨勢，但處理時間較短時差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與對照組相比，1 μmol/L ATRA組從第42天起AFP值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，10 μmol/L ATRA組從第14天起差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2 ATRA對HepG2細(xì)胞凋亡的影響在熒光顯微鏡下可以觀察到對照組的HepG2細(xì)胞核發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光(圖2)，而1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組可見核致密濃染的凋亡細(xì)胞(箭頭處為凋亡小體)，在第72天10 μmol/L ATRA組凋亡小體最多。統(tǒng)計顯示自第5天起1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組凋亡率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

2.3 ATRA對HepG2細(xì)胞增殖的影響MTT實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組從第2天開始生長受到抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；10 μmol/L ATRA組較1 μmol/L ATRA組對HepG2細(xì)胞的抑制程度更高(表3)。

2.4 ATRA對HepG2細(xì)胞遷移的影響對照組24 h遷移距離為(7.31±3.20) μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組24 h遷移距離分別為(12.28±1.97)μm和(10.50±3.12)μm；48 h對照組遷移距離為(40.03±4.68)μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組遷移距離分別為(36.15±4.72)μm和(27.41±2.49)μm; 72 h對照組遷移距離為(50.36±3.14)μm，1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA加藥組遷移距離分別為(45.76±4.35)μm和(29.63±2.40)μm。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，加藥組24、48、72 h細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離均低于同期對照組(圖3)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，10 μmol/L ATRA比1 μmol/L ATRA作用更強。

圖1 ATRA誘導(dǎo)HepG2分化在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的影響 ×100

表1 ATRA處理肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞后 γ-GT的比活性和AFP的分泌量

與對照組比較：*P<0.05

2.5 ATRA對HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響軟瓊脂克隆形成實驗表明HepG2細(xì)胞可以在軟瓊脂上形成克隆，與對照組相比，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組克隆數(shù)目減少，到72 d時1 μmol/L ATRA組仍可見少量克隆，但10 μmol/L ATRA組基本無克隆生長。提示HepG2細(xì)胞受到ATRA刺激后能明顯抑制HepG2腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成(圖4)。

圖2 ATRA對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響 ×200

表2 ATRA對肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的影響

與對照組比較：*P<0.05

3 討論

誘導(dǎo)分化劑治療惡性腫瘤的理論基礎(chǔ)是誘導(dǎo)分化劑可以使腫瘤細(xì)胞的分化潛能部分或全部恢復(fù)進(jìn)而轉(zhuǎn)化為正常細(xì)胞，或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而達(dá)到治療腫瘤的目的[4]。ATRA目前在臨床上常被用于急性早幼粒白血病的誘導(dǎo)分化治療[5]。本研究初步探討ATRA作用于人肝癌細(xì)胞株HepG2后，HepG2細(xì)胞分化、凋亡、遷移和克隆形成等生物學(xué)行為的變化。

本研究選擇γ-GT和AFP作為ATRA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化的觀察指標(biāo)。正常血清中γ-GT主要來自肝臟，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生癌變時活性逐漸上升且與惡變程度正相關(guān)，因此可以把γ-GT作為肝癌診斷的標(biāo)志物[6]。AFP主要由胎兒肝細(xì)胞及卵黃囊合成，正常成人無分泌，且分泌量與肝癌的惡性程度密切相關(guān)，AFP是肝癌特異性標(biāo)志物[7]，本研究選擇這兩個指標(biāo)作為觀察HepG2細(xì)胞分化的指標(biāo)。

表3 ATRA對肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響(n=6)

與對照組比較：*P<0.05

首先觀察了1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA藥物處理組對HepG2細(xì)胞分化的影響，結(jié)果顯示對照組HepG2成簇狀生長，細(xì)胞密度大，具有良好的光澤度，細(xì)胞形態(tài)不隨培養(yǎng)時間長短發(fā)生改變，經(jīng)過ATRA處理后HepG2細(xì)胞生長離散，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核變小且發(fā)生凹陷和分葉，胞質(zhì)增多，并隨著作用時間的延長形態(tài)學(xué)改變越明顯，與Arisi et al[8]的研究中細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變一致。結(jié)果分析顯示：同一處理時間段1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組的γ-GT比活性和AFP分泌量均低于對照組；組內(nèi)不同處理時間段之間γ-GT比活性和AFP分泌量也有差異。ATRA加藥組在誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞分化過程中隨處理時間的增加γ-GT比活性和AFP分泌量呈下低趨勢，表明ATRA處理的HepG2細(xì)胞惡性程度降低[9]。提示1 μmol/L ATRA和10 μmol/L ATRA具有誘導(dǎo)HepG2分化的作用。

圖3 ATRA對肝癌細(xì)胞HepG2遷移的影響×100

A：細(xì)胞劃痕實驗圖；B：細(xì)胞劃痕實驗柱狀統(tǒng)計圖；與24 h對照組比較：*P<0.05；與48 h對照組比較：#P<0.05；與 72 h對照組比較：△P<0.05

圖4 ATRA對肝癌細(xì)胞HepG2克隆形成能力的影響

MTT試驗結(jié)果表明，ATRA能夠抑制HepG2細(xì)胞的增殖，與對照組比較，ATRA加藥組細(xì)胞均自2 d時開始受到抑制，細(xì)胞抑制率隨處理時間的增加而增加，72 d時細(xì)胞抑制率最高達(dá)到59.043%。Hoechst染色結(jié)果顯示細(xì)胞對照組在熒光顯微鏡下細(xì)胞核發(fā)出均勻的藍(lán)色熒光，偶見凋亡細(xì)胞，而加藥組可見致密濃染的凋亡細(xì)胞、碎裂和凋亡小體。1 μmol/L ATRA處理72 d后，HepG2細(xì)胞凋亡率(6.244±1.462)%，10 μmol/L ATRA處理72 d后凋亡率為(9.458±2.246)%。說明ATRA不僅可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞向正常細(xì)胞再分化、抑制HepG2細(xì)胞增殖還可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡[10]。

根據(jù)劃痕實驗結(jié)果可以初步研究腫瘤細(xì)胞的遷移能力，通過判斷細(xì)胞對照組與加藥組劃痕的愈合距離來判斷細(xì)胞的遷移能力強弱[11]。實驗中觀察到在低濃度血清培養(yǎng)基中，1 μmol/L ATRA組和10 μmol/L ATRA組細(xì)胞劃痕間傷口愈合距離在24、48、72 h均低于對照組；提示ATRA具有抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力，且隨著藥物濃度的增加其抑制遷移的作用也隨之增強。

HepG2細(xì)胞對照組在軟瓊脂上形成較多的克隆，ATRA刺激后HepG2細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆形成減少，72 d后10 μmol/L ATRA組幾乎無克隆形成，但1 μmol/L ATRA組仍可見少量克隆。提示ATRA能夠抑制HepG2細(xì)胞在體外克隆形成能力且ATRA對HepG2克隆能力的抑制程度呈時間與劑量依賴。