汪 洋，余 婷，陳可洋

甲狀腺功能紊亂(thyroid dysfunction, TD)，即甲狀腺功能亢進(jìn)和甲狀腺功能減退，女性比男性患病率高。女性青春期必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)碘的需求增加，甲狀腺激素對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有重要意義。甲狀腺激素在青春期生殖系統(tǒng)的適當(dāng)發(fā)育和功能中發(fā)揮重要作用[1]。甲狀腺激素對(duì)生長(zhǎng)也存在不可忽視的作用。目前研究[2]提示青春期甲狀腺激素水平與骨質(zhì)發(fā)育有關(guān)聯(lián)，青春期甲狀腺功能亢進(jìn)患者可嚴(yán)重影響青少年的骨代謝，導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換加速，骨密度降低。

甲狀腺激素在葡萄糖代謝中起重要作用。正常機(jī)體胰島素分泌通過(guò)葡萄糖感受器調(diào)節(jié)，甲狀腺激素分泌同時(shí)影響胰島素[3]。三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine, T3)是生物活性激素，80%循環(huán)T3是活化的脫碘酶和單體碘化的四碘甲狀腺原氨酸(thyroxine, T4)在外周轉(zhuǎn)化而來(lái)，它主要負(fù)責(zé)葡萄糖代謝活動(dòng)[4]。

1 材料與方法

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3周齡C57BL/6J雌性小鼠(9～12 g)30只，從北京維通利華(Vital River)公司購(gòu)買。游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine, FT3)、游離四碘甲狀腺原氨酸(free thyroxine , FT4)試劑盒購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司；葡萄糖-6-磷酸激酶(glucose-6-phosphatase, G6Pase)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，磷酸烯醇式丙酮酸激酶(phosphoenol- pyruvate carboxykinase, PPEPCK)購(gòu)自美國(guó)cell signling technology公司；蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)前動(dòng)物自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，維持12 h光照和12 h黑暗的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)室溫度：20～25 ℃，濕度：(50±5)%。在上述環(huán)境適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分成3組：N組(正常對(duì)照組)10只、Pe組(甲狀腺功能亢進(jìn)組)10只、Po組(甲狀腺功能減退組)10只。

左旋甲狀腺素配置成溶液，按1.2 mg/kg灌胃處理小鼠28 d造甲狀腺功能亢進(jìn)模型；丙基硫氧嘧啶配置成溶液，按20 mg/kg灌胃處理小鼠28 d造甲狀腺功能減退模型。同時(shí)普通對(duì)照組動(dòng)物灌胃等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后每周測(cè)血糖水平及體質(zhì)量至8周取材。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵循“NIH實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物管理和使用指南”，盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛苦和減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量，禁止虐待動(dòng)物。8周后，將從雌性小鼠獲得的全血在3 000 r/min、4 ℃下離心20 min以收集血清。獲得的肝臟立即放入液氮中冷凍，并儲(chǔ)存在-80 ℃待提取組織蛋白備用。

1.2 生化指標(biāo)檢測(cè)以及蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)甲狀腺功能亢進(jìn)、甲狀腺功能減退小鼠在造模28 d后每組取3 只，使用ELISA試劑盒分析血清FT3、FT4確保造模成功，同時(shí)N組取3只小鼠測(cè)相同指標(biāo)作對(duì)照。蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)檢測(cè)肝臟組織中G6Pase、PEPCK的表達(dá)水平。

通過(guò)蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)測(cè)定靶蛋白的表達(dá)水平。用含有完全蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液制備肝勻漿。將裂解物在12 000 r/min、4 ℃下離心15 min。通過(guò)BCA測(cè)定法定量上清液提取物的蛋白質(zhì)濃度。將蛋白質(zhì)原液定量配制成上樣緩沖液，100 ℃下10 min變性，然后放在-20 ℃下保存。

對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，加入30～50 μg溶解的蛋白質(zhì)，通過(guò)10%～15% SDS-PAGE電泳分離(約2 h)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜(約2.5 h)，然后將載有目的蛋白的PVDF膜在室溫(25 ℃)浸沒于5%脫脂乳中孵育1 h，純水洗滌后與一抗G6Pase、PEPCK孵育。在搖床上過(guò)夜(4 ℃)。然后TBST洗滌膜并在室溫下與二抗孵育1～2 h，通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)靶蛋白。為了量化蛋白質(zhì)表達(dá)水平，在Image J軟件上對(duì)應(yīng)于每個(gè)樣品的印跡強(qiáng)度獲得密度測(cè)定的圖下面積。即獲得目的蛋白條帶，分析比較不同組間的差異。

2 結(jié)果

2.1 血清FT3、FT4檢測(cè)造模28 d后，每組分別取3只小鼠測(cè)血中FT3、FT4，以判斷甲狀腺功能亢進(jìn)甲狀腺功能減退造模是否成功。經(jīng)試劑盒檢測(cè)N組FT3濃度為(55.40±5.15)pmol/L，Pe組FT3濃度為(85.25±5.35)pmol/L，Po組FT3濃度為(20.72±2.23)pmol/L。N組FT4濃度為(58.41±3.53)pmol/L，Pe組FT4濃度為(86.07±2.39)pmol/L，Po組FT4濃度為(20.83±2.50)pmol/L。與N組相比，Pe組FT3、FT4水平升高(t=4.02,P<0.05;t=6.49,P<0.01)，Po組FT3、FT4水平降低(t=6.18,P<0.01;t=8.69,P<0.01)。見圖1。

2.2 體質(zhì)量及血糖檢測(cè)造甲狀腺功能亢進(jìn)甲狀腺功能減退模型從雌性小鼠青春期(4周齡)起，Pe組體質(zhì)量從造模21 d逐漸與Po組、N組拉開距離，生長(zhǎng)加快。造模結(jié)束(28 d)N組體質(zhì)量(18.23±0.13)g，Pe組體質(zhì)量(20.20±0.56)g，Po組體質(zhì)量(16.77±0.23)g。與N組相比，Pe組體質(zhì)量水平升高(t=3.45,P<0.01)，Po組體質(zhì)量水平降低(t=5.71,P<0.01)。

圖1 各組血清FT 3、FT 4檢測(cè)與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

造甲狀腺功能亢進(jìn)甲狀腺功能減退模型從雌性小鼠青春期(4周齡)起，Pe組血糖從造模7 d逐漸與N組、P0組拉開距離，血糖降低；Po組血糖從造模14 d逐漸與N組拉開距離，血糖升高。造模結(jié)束(28 d)N組血糖(5.23±0.26)mmol/L，Pe組血糖(4.12±0.22)mmol/L，Po組血糖(7.33±0.58)mmol/L。與N組相比，Pe組血糖水平降低(t=3.30,P<0.01)，Po組血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)。甲狀腺功能亢進(jìn)鼠呈低血糖狀態(tài)，甲狀腺功能減退鼠呈高血糖狀態(tài)，見圖2。

2.3 肝臟組織中G6Pase、PEPCK的表達(dá)G6Pase和PEPCK是催化糖原異生的決定性蛋白，因此在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。G6Pase蛋白的表達(dá)在各組有差異。與N組相比，Pe組蛋白表達(dá)水平升高(t=8.50,P<0.01)，Po組體蛋白表達(dá)水平升高(t=3.40,P<0.05)。PEPCK蛋白的表達(dá)略有不同。與N組相比，Pe組蛋白表達(dá)水平升高(t=14.92,P<0.01)，Po組蛋白表達(dá)無(wú)差異(t=2.43,P>0.05)，見圖3。

3 討論

3.1 甲狀腺激素對(duì)青春期生長(zhǎng)的短期影響甲狀腺激素被稱為代謝、生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)雌性小鼠青春期生長(zhǎng)。甲狀腺功能亢進(jìn)導(dǎo)致青春期雌性小鼠體質(zhì)量增加迅速，甲狀腺功能減退導(dǎo)致體質(zhì)量增加緩慢。Shiraki et al[5]研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能減退導(dǎo)致體質(zhì)量降低，Kiyohara et al[6]研究結(jié)果表明甲狀腺功能減退狀態(tài)可能對(duì)青春期發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響，體質(zhì)量增長(zhǎng)的變化與本研究結(jié)果一致。甲狀腺激素紊亂對(duì)雌性小鼠不同生長(zhǎng)階段作用略有區(qū)別，有研究[7]指出老年雌性甲亢甲減小鼠體質(zhì)量均降低，這可能是由于青春期促生長(zhǎng)作用更明顯。流行病學(xué)調(diào)查顯示，兒童期缺乏甲狀腺激素是矮小癥患兒發(fā)病的重要原因[8]。研究[1]表明下丘腦-垂體-甲狀腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸之間存在相互作用。青春期是重要的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，甲狀腺激素紊亂對(duì)其影響不僅僅體現(xiàn)在生長(zhǎng)方面，而且對(duì)女性青春發(fā)動(dòng)期的性腺發(fā)育及性器官成熟有重要意義。本研究的不足之處在于沒有進(jìn)一步探究對(duì)雌性小鼠青春期發(fā)育的影響。

圖2 體質(zhì)量及血糖檢測(cè)

A：造模期體質(zhì)量；B：造模期血糖；C：造模28 d體質(zhì)量；D：造模28 d血糖；與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖3 肝臟組織中G6P、PEPCK的表達(dá)

A：肝臟組織中G6P、PEPCK的蛋白條帶；B：肝臟組織中G6P、PEPCK各自與β-actin的比值；與N組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 甲狀腺激素與糖異生相關(guān)蛋白的表達(dá)甲狀腺激素與能量代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，與糖代謝的調(diào)節(jié)也是密不可分。甲狀腺功能亢進(jìn)狀態(tài)下，葡萄糖氧化率增加，胰島素敏感性降低[9]。有研究[10]表明甲狀腺素可增加大鼠卵巢中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4表達(dá)。甲狀腺激素通過(guò)這些可能的途徑影響糖代謝水平。

與N組相比，甲狀腺功能亢進(jìn)小鼠G6Pase蛋白表達(dá)水平升高(t=8.50,P<0.01)，PEPCK蛋白表達(dá)水平升高(t=14.92,P<0.01)。這兩種催化糖原異生的蛋白表達(dá)水平升高，糖異生增強(qiáng)。然而甲狀腺功能亢進(jìn)小鼠血糖水平卻降低，可能是由于葡萄糖氧化率增加，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平提高導(dǎo)致糖異生的速度趕不上葡萄糖消耗的速度，能量用于生長(zhǎng)所需以及維持加速的循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)。

與N組相比，甲狀腺功能減退小鼠G6Pase催化糖原異生的蛋白表達(dá)增強(qiáng)(t=3.40,P<0.05)，糖異生增強(qiáng)。同時(shí)甲狀腺功能減退會(huì)降低胃腸道葡萄糖的吸收，肝臟葡萄糖生成幾乎完全停止以及胰島素水平增加[9]。甲狀腺功能減退小鼠血糖水平升高明顯，可能是由于葡萄糖生成途徑增加以及能量代謝減慢疊加的效果。

3.3 甲狀腺激素與血糖水平的意義一項(xiàng)對(duì)德國(guó)和奧地利276名兒童和青少年1型糖尿病(diabetes mellitus type 1, T1DM)患者的甲狀腺功能亢進(jìn)癥調(diào)查表明，伴有甲狀腺功能亢進(jìn)的T1DM患者低血糖發(fā)生率更高[11]。甲狀腺功能亢進(jìn)與胰島素不足是否存在相關(guān)性值得引起注意，更高的低血糖發(fā)生率對(duì)伴有甲狀腺功能亢進(jìn)的T1DM患者并發(fā)癥防治具有前瞻性意義。格雷夫斯眼病(自身免疫性甲狀腺相關(guān)性眼病)患者存在自發(fā)性低血糖。青春期甲狀腺功能亢進(jìn)可能需預(yù)防低血糖的風(fēng)險(xiǎn)。

有隊(duì)列研究[12]表明甲狀腺功能減退是新發(fā)糖尿病的危險(xiǎn)因素。與N組相比，該研究中雌性小鼠的血糖水平升高(t=5.18,P<0.01)，青春期甲狀腺功能減退存在發(fā)展成為2型糖尿病的潛在風(fēng)險(xiǎn)，高血糖的持續(xù)狀態(tài)甚至可能影響雌性小鼠成年期。

甲狀腺疾病對(duì)青春期女性的危害不容忽視。但甲狀腺激素水平影響糖脂代謝的信號(hào)通路的哪些環(huán)節(jié)，相關(guān)分子機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。這或許為女性青春期甲狀腺功能紊亂治療提供新的視角。