卜寶英， 徐喜媛Δ, 韓俊萍, 楊敬平

(1. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科， 包頭 014010； 2. 邯鄲第一醫(yī)院， 河北 邯鄲 056000)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)指肺動脈壓力異常增高的病理生理改變，可致右心衰竭，嚴重影響患者生活及生存狀態(tài)[1]。低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)指低氧導(dǎo)致了肺血管收縮及肺小動脈中層平滑肌細胞的異常增生發(fā)病，多發(fā)生于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)和慢性高原病中，目前尚無特異性治療HPH的有效方法[1]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)是高度保守的損傷相關(guān)分子模式小分子，能被免疫活性細胞主動分泌，也可被損傷和壞死的細胞被動釋放，參與炎癥、細胞分化、細胞遷移、細胞增殖、組織再生、干細胞招募/激活、組織重構(gòu)和腫瘤發(fā)展，在COPD及PH等發(fā)病中起重要作用[2]。Yukari等[3]發(fā)現(xiàn)在PH小鼠模型中HMGB1表達增加，同時炎癥反應(yīng)增強、肺血管壁增厚，抗HMGB1抗體可減弱上述反應(yīng)。本研究通過觀察低氧對人肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cell, HPASMC)和人肺動脈內(nèi)皮細胞(human pulmonary artery endothelial cells ,HPAEC)中HMGB1及相關(guān)炎癥因子表達的影響，闡明其在HPH發(fā)病中對血管炎癥、內(nèi)皮細胞增殖、遷移等可能的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HPASMC和HPAEC購于ATCC細胞庫(美國模式培養(yǎng)物集存庫)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640、標準胎牛血清購于美國BI公司。胰蛋白酶、雙抗購于美國Sigma公司。RNA提取試劑盒購于上海生工生物有限公司。TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。Platinum?定量 PCR SuperMix-UDG試劑盒購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。RNase I購于寶生物工程(大連)有限公司(大連TakaRa公司)。MTS試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。人重組HMGB1蛋白購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

根據(jù)購得的HPAEC,HPASMC細胞培養(yǎng)說明書，HPASMC細胞所用培養(yǎng)基是DMEM高糖培養(yǎng)基+10%FBS，HPAEC細胞所用培養(yǎng)基是RPMI-1640培養(yǎng)基+327 pmo/L IGF +414 pmol/L EGF+15%的標準胎牛血清,在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.3 PCR檢測HMGB1及相關(guān)受體和炎癥因子在 HPASMC和HPAEC的表達

將第5代的HPAEC和HPASMC細胞按106cells/ml密度分別接種于2個中皿中培養(yǎng)，分對照組(Control組)和低氧組(Hypoxia組)，Control組氧濃度不變，Hypoxia組放入低氧(氧濃度1%)培養(yǎng)箱，待細胞長到80%時，取出細胞，提取總RNA。去除基因組DNA反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄PCR，Real Time PCR檢測HMGB1和TLR4、9、2及SIGLE10、RAGE、CD24與IL-6 、TNF-α和CXCL8 mRNA的表達。

1.4 MTS法測定細胞增殖

細胞以約2×104cells/well細胞濃度分別接種在96孔板上，培養(yǎng)24 h。然后饑餓培養(yǎng)基(去血清 0.1%BSA)處理培養(yǎng)過夜。棄去饑餓培養(yǎng)基，再在各組中加入不同濃度的HMGB1刺激(3.45 pmol/L、34.5 pmol/L及 345 pmo/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。避光條件下每孔加入20 μl MTS，繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h。分光光度計在490 nm,630 nm波長處檢測每孔的光吸收值(OD值) ，代表細胞存活率。

1.5 細胞遷移

在體外培養(yǎng)皿的單層貼壁細胞上，用200 μl黃槍頭在細胞的中央?yún)^(qū)域劃線，用1 μmol/L的HMGB1的饑餓培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞(不含HMGB1的饑餓培養(yǎng)基作對照)，在0、 8、12、24 h取出細胞培養(yǎng)板，拍照記錄細胞生長(修復(fù))至中央劃痕區(qū)的細胞數(shù), 遷移細胞數(shù)值以每次單獨遷移實驗中2～3個復(fù)孔中遷移數(shù)目的均數(shù)+標準差代表。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HPASMC、HPAEC內(nèi)HMGB1及受體的表達

Realtime-PCR檢測HPASMC和HPAEC中HMGB1及其受體(TLR4、9、2及SIGLE10、RAGE、和CD24)mRNA的表達見表1和表2。結(jié)果顯示：HPAEC和HPASMC中Hypoxia組與Control組比較HMGB1表達明顯提高(t=2.69和4.31,P<0.05和0.01)，RAGE亦明顯增高(t=2.51和4.51,P<0.05和0.01)，TLR2明顯下降(t=3.99和2.54,P均< 0.05)。Hypoxia組HPAEC中CD24較Control組明顯增高(t=2.86,P<0.05)。HPAEC和HPASMC中Hypoxia組與Control組比較余其它指標均無明顯差異(P均>0.05)。

2.2 HPASMC、HPAEC內(nèi)IL-6、TNF-α、CXCL8 mRNA的表達

RT-PCR檢測IL-6、TNF-α、CXCL8 mRNA的表達見表3。結(jié)果顯示：HPASMC中Hypoxia組IL-6的表達較Control組明顯增高(t=2.39,P<0.05)，TNF-a 及CXCL8的表達無明顯差異(P均<0.05);兩組HPAEC中IL-6、TNF-α及CXCL8的表達無明顯差異(t=1.23、1.62及1.34,P均>0.05)。

Tab. 1 The expression levels of HMGB1 and its receptor mRNA in HPAEC of hypoxia and control group (relative to GAPDH gene ×106, n=6)

HMGB1: High mobility group box-1; RAGE: Receptor of advanced glycation end products; TLR: Toll-like receptor

*P<0.05vscontrol group

Tab. 2 The expression levels of HMGB1 and its receptor mRNA in HPASMC of hypoxia and control group (relative to GAPDH gene ×106, n=6)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

Tab. 3 The expressions of cytokines mRNA in HPAEC and HPASMC of hypoxia and control group (relative to GAPDH gene ×106, n=6)

HPAEC: Human pulmonary artery endothelial cells; HPASMC: Human pulmonary artery smooth muscle cell

*P<0.05vscontrol group

2.3 MTS法測定細胞增殖

不同HMGB1劑量對HPAEC及HPASMC 培養(yǎng)的增殖結(jié)果見表4。其中，與饑餓培養(yǎng)基(Starvation medium)相比加入345 pmol/L HMGB1的HPAEC培養(yǎng)抑制作用有顯著性(t=7.391,P<0.01)。各濃度HMGB1對HPASMC的增殖無影響。

Group HPAECHPASMCHStarvation medium0.2567±0.04310.4977±0.0068HMGB1/0.1 μmol/L0.2353±0.00780.5107±0.0270HMGB1/1 μmol/L0.2293±0.01690.5427±0.0474HMGB1/10 μmol/L0.2040±0.0069??0.4947±0.0215

**P<0.01vsstarvation medium

2.4 HPAEC、HPASMC遷移實驗

HPAEC、HPASMC在0 h、8 h、12 h和24 h劃痕實驗結(jié)果見圖1和圖2，可直接分辨出各組細胞遷移至劃痕區(qū)域數(shù)目的差異。24 h含HMGB1及不含HMGB1的饑餓培養(yǎng)基(control)的HPAEC、HPASMC 遷移數(shù)目分別為43.33+2.88 cells 及 45.00+3.60 cells(t=1.47,P>0.05)、40.67+1.20 cells及42.33+1.45 cells(t=1.36,P>0.05)。

Fig.1Effect of HMGB1 on HPAEC migration

Fig.2Effect of HMGB1 on HPASMC migration

3 討論

HPH是一種致死性疾病，是慢性肺源性心臟病和慢性高原病的重要發(fā)病機制[4]，肺動脈高壓原因之一是HPAECs和HPASMCs由于炎癥導(dǎo)致舒縮功能及增殖異常，肺動脈重塑，最終導(dǎo)致右心衰[5]。目前以促進血管舒張為目的治療只能在有限的時間內(nèi)改善HPH的臨床癥狀和血流動力學(xué)，不能治愈該病[1]，故急需發(fā)現(xiàn)新的治療方法來治療肺動脈高壓，減輕肺動脈高壓患者的痛苦。HMGB1是一種主要與細胞核DNA結(jié)合的非組蛋白。細胞外HMGB1是一種重要的晚期炎癥遞質(zhì)，參與炎癥免疫反應(yīng)、腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移[6]。低氧狀態(tài)下，HMGB1由活化的炎癥細胞主動釋放，或由壞死細胞被動釋放，釋放的細胞外HMGB1進一步誘導(dǎo)單核/巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞分泌炎癥細胞因子[6]。可見，HMGB1不僅可作為促炎因子直接參與組織損傷，還在低氧時作為炎癥介質(zhì)加重炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

HMGB1作為細胞外信號分子和DAMP分子激活模式識別受體，即免疫細胞表達的表面受體，比如 Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products, RAGE)，激活胞內(nèi)p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)、核因子(nuclear factor kappa beta, NF-κB)等下游信號通路，導(dǎo)致促炎因子的釋放、樹突細胞的成熟及平滑肌細胞的趨化和增殖[7-8]。Yukari[3]等研究發(fā)現(xiàn)在動物實驗野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓小鼠模型中HMGB1被釋放到細胞外間隙，并且抗HMGB1抗體能夠減輕肺血管的炎癥和肌化，從而減輕肺動脈高壓的進展。本實驗通過觀察低氧誘導(dǎo)的HMGB1對HPAEC和HPASMC兩種細胞的作用，結(jié)果表明，在低氧(1%氧濃度)狀態(tài)下HPASMC、HPAEC中HMGB1表達量與正常對照組比較都明顯升高(P<0.05及0.01)，在HPASMC中升高尤其明顯，說明內(nèi)皮細胞和平滑肌可能是肺動脈高壓中外周HMGB1增加的來源,與上述報道一致。本課題檢測了HMGB1及其受體RAGE、TLR2、TLR4、TLR9、CD24、SIGLEC10 mRNA低氧刺激后的表達，結(jié)果顯示：HPASM及CHPAEC中RAGE高表達(P<0.05及0.01)，表明兩種細胞低氧引起的HMGB1主要受體為RAGE； HPAEC中CD24受體表達明顯增高(P<0.05)，而TLR2表達降低(P< 0.05)，表明HPAEC中低氧引起的HMGB1可能參與的受體還包括CD24。RAGE在肺組織中非常豐富，并且是HMGB1的重要的受體，研究發(fā)現(xiàn)RAGE在肺血管阻力增加引起右心肥厚中起作用，與在用西餐飼養(yǎng)的小鼠心臟肥大中的作用一致[9]。Moser等[10]研究表明血清中RAGE和HMGB1在慢性栓塞性肺動脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH)病人的成纖維細胞中表達增加，RAGE在特發(fā)性肺動脈高壓(idiopathic pulmonary artery hypertension, IPAH)病人典型病變肺組織中表達增加，并且行肺動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)只能局部控制疾病并不能通過RAGE通路改變CTEPH的全身炎癥機制。所以，HMGB1可以通過RAGE-HMGB1軸表達增加，從而在HPH的發(fā)生及發(fā)展中起作用。本研究結(jié)果中TLR的作用與以往研究[8]不同，可能與樣本量有關(guān)，需要進一步探討。

HMGB1可刺激多種與PH發(fā)病機制相關(guān)的促炎因子的產(chǎn)生，這些促炎介質(zhì)直接作用于血管結(jié)構(gòu)細胞，直接改變血管微環(huán)境，炎癥細胞中HMGB1具有很強的免疫反應(yīng)性，內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞釋放HMGB1激活炎癥反應(yīng)[11]。本實驗研究了HPAEC和HPASMC在低氧刺激后IL-6、CXCL8、TNF-α的表達，結(jié)果顯示： HPASMC的IL-6的表達明顯增高(P<0.05)，而不影響HPAEC的IL-6及兩種細胞TNF-α、CXCL8 的表達。IL-6是一種可以由單核細胞、上皮細胞、血管內(nèi)皮細胞和血管平滑肌等多種細胞產(chǎn)生的細胞因子，HMGB1和內(nèi)毒素可促進平滑肌和單核細胞共培養(yǎng)中IL-6的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)IL-6的過度表達促進PH，基因沉默后抑制PH的發(fā)展[8,12]。但HMGB1是否直接參與調(diào)控IL-6的產(chǎn)生有待進一步研究。

HMGB1不僅可作為免疫細胞的趨化因子，還可作為平滑肌細胞和干細胞的趨化因子，在許多疾病中引起損傷或修復(fù)，HMGB1通過其趨化作用和抗凋亡功能參與肺血管平滑肌細胞的肺血管重構(gòu)[8,10-13]。HMGB1可作為一種趨化因子，可以促進包括內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞在內(nèi)的多種細胞增殖并對HPASMC細胞遷移有影響[13-15]。我們MTS實驗結(jié)果表明HMGB1劑量依賴地抑制HPAEC的增殖，對HPASMC增殖無影響，這與Bauer[15]等人的研究結(jié)果一致。劃痕實驗結(jié)果顯示HMGB1對HPASMC和HPAEC遷移無明顯影響。HPASMC中低氧誘導(dǎo)的HMGB1對HPASMC增殖、遷移沒有影響，表明低氧誘導(dǎo)的HMGB1不直接參與血管重塑；HPAEC中低氧誘導(dǎo)的HMGB1劑量依賴地抑制HPAEC增殖，但對遷移沒有影響，對炎癥因子表達沒有影響，表明HMGB1可引起內(nèi)皮功能障礙。有關(guān)HMGB1對HPASMC、HPAEC細胞增殖、遷移的文獻結(jié)果存在差異，我們認為可能是由于HMGB1的濃度不同造成的，有相關(guān)文獻報道了HMGB1對這兩種細胞不同的增殖效果[16-17]，所以HMGB1對肺動脈高壓的形成能否通過平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞起作用，還需要進一步的研究。