郝家樂， 徐立聰， 黃天鵬， 余 艷， 王瑤堯， 范小芳， 龔永生， 毛孫忠

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

低氧誘導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs)異常增殖是低氧性肺動(dòng)脈高壓重要的病理學(xué)特征[1]。本課題組最新的研究發(fā)現(xiàn)：低氧誘導(dǎo)肺組織載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)蛋白表達(dá)下調(diào)參與小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成[2]，研究發(fā)現(xiàn)，外源性apoE能抑制血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[3]，尚不清楚apoE是否對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)在原代培養(yǎng)小鼠PASMCs上，探討外源性apoE對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖的影響及可能機(jī)制，旨在為低氧性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病及防治機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級(jí)野生型雄性C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬2017-0063)，apoE(人血漿提取物，Sigma公司)，apoE抗體、鈣調(diào)節(jié)蛋白(Calponin)抗體、α肌動(dòng)蛋白(α-SM actin)抗體、增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體(Abcam公司)，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抗體、磷酸化蛋白激酶C(phosphorylated protein kinase C，p-PKC)抗體(Santa Cruz公司)，GADPH(CST公司)，EdU摻入試劑盒(銳博生物有限公司)。

1.2 PASMCs原代培養(yǎng)

采用組織塊貼壁法原代培養(yǎng)小鼠PASMCs[4]：頸椎脫臼法處死小鼠，75%酒精中浸泡5 min。無菌條件下分離肺動(dòng)脈(含肺動(dòng)脈主干和左、右肺動(dòng)脈干)，在外科手術(shù)顯微鏡下盡可能徹底剝除肺動(dòng)脈外膜，然后縱向剪開，用手術(shù)刀片輕輕刮除肺動(dòng)脈內(nèi)皮，再將肺動(dòng)脈中膜剪成0.5～1mm3組織塊，以1塊/cm2的密度接種于50 ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。

1.3 PASMCs鑒定

培養(yǎng)好的細(xì)胞用抗α-SM actin抗體和抗Calponin抗體行免疫熒光法顯色，α-SM actin和Calponin雙陽性細(xì)胞為PASMCs。

1.4 PASMCs分組與處理[4]

取3～5代生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期PASMCs，按1×105cells/well接種于6孔板中，貼壁后長至50%融合，無血清處理24 h使細(xì)胞周期同步化并隨機(jī)分為四組：常氧組，常氧+apoE組，低氧組和低氧+apoE組。常氧組培養(yǎng)條件為：1% FBS DMEM/F12，21% O2，5% CO2，37℃；低氧組培養(yǎng)條件為：1% FBS DMEM/F12，1% O2，5% CO2，37℃，外源性加apoE使終濃度為10 μg/ml[5]，培養(yǎng)時(shí)間為48 h，重復(fù)三次；48 h后檢測(cè)PASMCs增殖率，apoE、PCNA、PKC以及p-PKC等蛋白表達(dá)的變化。

1.5 PASMCs增殖檢測(cè)

采用EdU摻入法測(cè)定細(xì)胞增殖(具體步驟參考銳博生物公司試劑盒說明書)：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔 4×103～1×105細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。各組細(xì)胞加入50 μmol/L EdU培養(yǎng)基500 μl，孵育2 h，然后固定細(xì)胞，EdU進(jìn)行染色(紅色)，再對(duì)DNA進(jìn)行Hoechst33342染色處理，熒光顯微鏡下隨機(jī)拍攝20個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)總的細(xì)胞核數(shù)(藍(lán)色)與增殖細(xì)胞數(shù)(紫色)，細(xì)胞增殖率=增殖細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 PASMCs蛋白表達(dá)檢測(cè)

PASMCs中加RIPA裂解液600 μl以制備勻漿。經(jīng)SDS-PAGE Bio-Rad電泳分離(上樣總蛋白量為20 μg)，4℃電轉(zhuǎn)膜過夜，封閉后依次加入apoE(1∶200)、PCNA(1∶500)、PKC(1∶400)、p-PKC(1∶400)和GADPH(1∶2 500)一抗，二抗，選用超敏型化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，置于Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光、成像。Image Lab 4.0圖像分析軟件分析處理，以GADPH為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白間的相對(duì)比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)小鼠PASMCs的鑒定

免疫熒光顯示α-SM actin和Calponin陽性細(xì)胞，α-SM actin和Calponin雙陽性的PASMCs高達(dá)97%(圖1)。

Fig.1The primary cultured PASMCs were identified by immunocytochemistry (×200)

2.2 ApoE對(duì)小鼠PASMCs增殖的影響

常氧組PASMCs增殖率與常氧+apoE組無顯著性差異(46.67±3.88vs40.42±1.48，P>0.05)；低氧組PASMCs增殖率較常氧組高64.7%(76.88± 2.09vs46.67±3.88，P<0.05)；低氧+apoE組PASMCs增殖率較低氧組低19.6%(61.83±1.98vs76.88±2.09，P<0.05，圖2A，2B)。

Fig.2Effects of apoE on the proliferation of PASMCs induced by hypoxia(×200,n=3)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia

2.3 ApoE對(duì)小鼠PASMCs的PCNA、PKC和p-PKC蛋白表達(dá)的影響

低氧組apoE蛋白表達(dá)較常氧組下調(diào)51.0%(P<0.05，圖3A，3B)。

常氧組PCNA蛋白表達(dá)與常氧+apoE組無顯著性差異(P>0.05)；低氧組PCNA蛋白表達(dá)較常氧組上調(diào)69.0%，低氧+apoE組PCNA蛋白表達(dá)較低氧組下調(diào)19.8%(P均<0.05，圖3C，3D)。

各組間PKC蛋白表達(dá)無顯著性差異，常氧組p-PKC蛋白表達(dá)與常氧+apoE組無顯著性差異(P均>0.05)；低氧組p-PKC蛋白表達(dá)較常氧組上調(diào) 120.0%，低氧+apoE組p-PKC蛋白表達(dá)較低氧組下調(diào)103.2%(圖3C，3D，P均<0.05)。

Fig.3Effects of apoE on relative protein expressions of PASMCs induced by hypoxia (n=3)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vshypoxia

3 討論

ApoE是低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體的配體，通過LDL受體由肝攝取膽固醇酯殘粒，對(duì)維持血漿膽固醇水平發(fā)揮重要作用，是降低血漿中ox-LDL含量和抑制血管壁動(dòng)脈粥樣硬化斑形成的保護(hù)因子，與高脂血癥和冠心病密切相關(guān)，目前主要應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的研究。近年的研究表明：肺動(dòng)脈高壓的形成與機(jī)體脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切[6-7]。本課題組先近的研究表明：脂質(zhì)代謝異常參與單純低氧誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓的形成[8]，最新的研究結(jié)果顯示：小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓形成與低氧誘導(dǎo)肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)[2]。已知PASMCs增殖堆積是低氧誘導(dǎo)的肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓形成的重要因素，抑制PASMCs增殖可改善低氧誘導(dǎo)的肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓[9]。研究發(fā)現(xiàn)，作為一種蛋白質(zhì)因子，apoE還具有抗炎、抗脂質(zhì)氧化以及抑制PDGF介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等作用[5,10]，尚不清楚apoE是否對(duì)低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖具有抑制作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低氧組PASMCs增殖率較常氧組顯著升高，PCNA蛋白顯著上調(diào)，同時(shí)apoE蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，提示低氧可誘導(dǎo)PASMCs增殖，低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖與apoE蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)，這與之前在整體動(dòng)物模型上的研究結(jié)果相符[2]。PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛存在于機(jī)體的組織細(xì)胞內(nèi)中，是磷脂肌醇信號(hào)途徑的中心環(huán)節(jié)，參與多種生理功能的調(diào)控，如調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移等，Dempsey等[11]報(bào)告低氧經(jīng)活化PKC途徑誘導(dǎo)PASMCs增殖，Jiang等[12]的研究發(fā)現(xiàn)PKCα通過激活ERK1/2途徑進(jìn)而促進(jìn)低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低氧組與常氧組間PKC蛋白表達(dá)無顯著性差異，低氧組p-PKC蛋白表達(dá)較常氧組顯著上調(diào)，這與上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖與PKC途徑活化有關(guān)。

值得注意的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：apoE組PASMCs增殖率較低氧組顯著降低，PCNA蛋白顯著下調(diào)，同時(shí)p-PKC蛋白表達(dá)亦顯著下調(diào)，研究發(fā)現(xiàn)，抑制PKC途徑可拮抗低氧誘導(dǎo)的PASMCs增殖[13]，提示外源性apoE抑制低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖作用可能通過抑制PKC途徑活化來實(shí)現(xiàn)，其可能的機(jī)制與apoE抑制ERK1/2通路有關(guān)[14]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。目前，至少發(fā)現(xiàn)有13種PKC亞型(不同物種、不同組織細(xì)胞中PKC亞型分布不同)，根據(jù)激活物的差異分類，α、βI、βII和γ等經(jīng)典PKC亞型的激活物為Ca2+和甘油二酯，而新穎PKC亞型如ε、θ、η、δ和μ等受甘油二酯激活，非經(jīng)典PKC亞型如ζ、ι和λ受其它脂質(zhì)衍生物激活[15]。研究發(fā)現(xiàn)，肺血管主要表達(dá)PKCα、PKCβI、PKCβII、PKCδ、PKCε和PKCη，低氧通過激活PKCα誘導(dǎo)PASMCs增殖[12]，慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚的發(fā)生與肺血管PKCα、PKCβI、PKCβII和PKCδ表達(dá)異常有關(guān)，而與PKCε和PKCη無關(guān)[16]，apoE是經(jīng)哪些PKC亞型抑制低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖有待進(jìn)一步的研究。同樣的，外源性apoE是否具有改善低氧誘導(dǎo)的肺血管重塑作用，apoE防治低氧性肺動(dòng)脈高壓具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的探究。

綜上所述，apoE能抑制低氧誘導(dǎo)小鼠PASMCs增殖，其可能機(jī)制與阻礙PKC途徑有關(guān)。進(jìn)一步研究apoE防治低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用，不僅有助于擴(kuò)展對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，而且可為低氧性肺動(dòng)脈高壓的防治提供新的思路。