陳少青， 萬 全， 白婷婷， 王春貴， 宣麗穎， 王 羽△， 趙 明△

(1. 內蒙古民族大學附屬醫(yī)院， 通遼 028000； 2. 內蒙古民族大學醫(yī)學院， 通遼 028000)

缺血性心肌病是慢性冠脈疾病類型之一,主要表現為心室擴大及心力衰竭[1]。其原因是由于長期冠脈缺血導致心肌細胞死亡及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑。目前認為，在細胞死亡類型中除了壞死和凋亡外，還存在一種Ⅱ型程序性死亡，即自噬。自噬在心臟疾病發(fā)展中具有雙重作用，在一些情況下，自噬可以降解損傷的細胞器，提供氨基酸及游離脂肪酸，對心肌細胞具有保護作用，但自噬過度激活卻對心肌產生損傷[2]。內質網是真核細胞內由動態(tài)變化的囊狀和管狀結構組成的重要細胞器。新合成的膜蛋白與分泌蛋白的折疊與糖基化修飾、脂質的合成以及Ca2+的貯存均在內質網中進行。當各種原因導致內質網穩(wěn)態(tài)失衡時，出現誤折疊蛋白在內質網內異常聚集并引起內質網應激性蛋白分泌增加，識別錯誤折疊蛋白，通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應過程即內質網應激反應(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。目前關于缺血性心肌病心肌重塑與內質網應激及自噬相關性報道較少，本研究通過結扎冠狀動脈前降支建立缺血性心肌病大鼠模型，觀察其大鼠心肌重塑、內質網應激和自噬的相關蛋白的表達情況，探討缺血性心肌病心肌重塑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物藥品與儀器

GRP78抗體，LC3-I抗體、LC3-II抗體、Beclin-I抗體購自Boster公司，內參β-actin購自wanleibio公司；BL-420生物機能實驗系統購自成都泰盟軟件有限公司。36只體重180～220 g雄性SD大鼠。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制備

選體重180～220 g清潔級雄性大鼠36只，隨機分為正常對照組、假手術組、缺血性心肌病組，每組12組。正常對照組未進行任何處理；假手術組及缺血性心肌病組大鼠用20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開頸部皮膚并分離氣管，做氣管插管與人工呼吸機相連，按肢體標準Ⅱ導連接BL420生理儀記錄心電圖。呼吸頻率60 beats/min，呼吸比率為3∶1，通氣量1 ml/g。沿胸骨左緣第二，三肋間隙迅速打開胸腔及心包，暴露心臟，用0/3號縫合線從左心耳下緣1 mm 處進針，于肺動脈圓錐左緣出針，將心臟復位，結扎冠狀動脈前降支，關閉胸腔，觀察心電圖變化，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型是否成功的標志，缺血20 min后，迅速打開胸腔，解開結扎線行再灌注，關胸并記錄心電圖變化。假手術組大鼠在相同位置只穿線而不結扎冠狀動脈。手術結束關閉及縫合胸腔，關閉呼吸機拔出氣管插管縫合氣管創(chuàng)口及頸部皮膚，從手術日開始每日觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括飲食，毛色，活動和排泄情況。

1.3 心臟彩超檢測

實驗開始第2周、第4周，各組大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥進行麻醉，行心臟超聲檢查心臟結構變化及心臟功能。

1.4 病理取材及切片制作

第4周心臟彩超檢查后，立即處死大鼠，在無菌狀態(tài)下剪開大鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟，將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液固定，經乙醇脫水，石蠟包埋，切片，將心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE、masson染色，于光鏡下觀察病理變化。同時取左心室組織放入4%戊二醛溶液固定，準備行電鏡觀測超微組織變化。

1.5 Western blot檢測各組小鼠心肌細胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達

采用RIPA裂解液提取各組大鼠心肌細胞蛋白質后，配置10%SDS-PAGE蛋白膠后，加樣并跑膠，跑膠程序設置為90 V 進行15 min后，150 V進行1 h，應用半干轉膜儀進行轉模， 5% BSA 37℃封閉1 h后，加入一抗GRP78(1∶1 000)，LC3-I(1∶ 1 000)，LC3-II(1∶1 000)，Beclin-1 (1∶1 000)，4℃孵育過夜后，次日PBST洗膜3次每次10 min后，二抗37℃孵育1 h，PBST洗膜3次每次10 min。ECL顯影檢測小鼠心肌細胞內質網應激相關蛋白GRP78與自噬相關蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠精神、飲食、活動、毛色及死亡數量的變化

對照組及假手術組大鼠毛發(fā)光亮，體質量隨時間增加，缺血性心肌病組大鼠毛發(fā)灰暗，體質量有所減輕，3組大鼠飼養(yǎng)及實驗過程中均未出現死亡。

2.2 各組大鼠心臟彩超變化

對照組及假手術組大鼠手術后2周及4周心臟超聲檢查心臟結構及功能未見明顯改變，與對照組及假手術組比較，缺血性心肌病組大鼠手術后2周及4周心臟超聲檢查心室擴大，EF值降低(圖1，表1)。

Fig.1Heart color Doppler ultrasound images of each group

A: Control group; B: Sham-operated group; C: Ischemic cardiomyopathy group (2 week); D: Ischemic cardiomyopathy group (4 week)

GroupEF%Control85±3Sham-operated82±4Ischemic cardiomyopathy (2 week)71±6??##Ischemic cardiomyopathy (4 week)64±2??##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssham-operated group

2.3 光鏡下心肌組織的變化

HE染色顯示：對照組與假手術組沒有明顯區(qū)別，與對照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠出現心肌纖維排列紊亂，心肌間質水腫；masson染色顯示：對照組與假手術組沒有明顯區(qū)別，與對照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠心肌纖維明顯增生(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。

2.4 心肌組織超微結構改變

對照組與假手術組沒有明顯區(qū)別，對照組大鼠心肌電鏡下肌節(jié)完整，線粒體清晰，心肌纖維排列整齊，缺血性心肌病大鼠線粒體空泡化嚴重，心肌纖維排列紊亂，肌節(jié)完整性受損(圖3)。

Fig.3Transmission electronic microscope images of rat cardiomyocyte

A: Control group; B: Ischemic cardiomyopathy group

2.4 Western blot檢測各組大鼠心肌細胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達變化

對照組與假手術組沒有明顯區(qū)別，與對照組及假手術組大鼠比較，缺血性心肌病組大鼠心肌GRP78、Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表達明顯增加(P<0.01，圖4，表2)。

Tab. 2 The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group n=12)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSham-operated group

Fig.4The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group

3 討論

當今，我國生活水平逐步提高，冠心病的發(fā)病率及由冠心病所致心力衰竭的發(fā)病率越來越高，而缺血性心肌病是慢性冠脈疾病類型之一。目前缺血性心肌病已成為全球常見影響生命的主要疾病。

本實驗采用結扎冠狀動脈前降支建立大鼠缺血性心肌病模型，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型是否成功的標志，缺血20 min后，迅速打開胸腔，解開結扎線行再灌注，關胸并記錄心電圖變化。模型建立成功后，超聲心動圖檢測各大鼠心功能，發(fā)現心臟超聲檢查心室擴大，EF值降低。病理檢測發(fā)現缺血性心肌病大鼠心肌損傷，心肌纖維化明顯，說明缺血性心肌病大鼠有明顯的心肌重塑現象。電鏡觀察缺血性心肌病大鼠心肌超微結構出現線粒體空泡及肌纖維排列紊亂及斷裂，心肌缺血、缺氧后心肌細胞線粒體受損，影響心肌細胞氧化磷酸化， ATP產生減少，引發(fā)心肌細胞死亡及纖維組織增生。文獻報道ATP產生減少可能引發(fā)內質網應激[4]。葡萄糖調節(jié)蛋白78KD(GRP78)是熱休克蛋白家族中的一類，是一種多功能鈣離子結合蛋白，參與細胞內蛋白質的折疊、轉運和降解[5]。GRP78是內質網應激的分子伴侶，實驗發(fā)現缺血性心肌病大鼠心肌中GRP78蛋白表達增高，說明缺血性心肌病與內質網相關。自噬在心血管疾病中具有重要作用。目前大部分研究認為自噬是內質網應激條件下誤折疊蛋白促進細胞存活的機制；通過促進未折疊蛋白的清除、清除受損傷的線粒體或者內質網，自噬可以恢復細胞的穩(wěn)態(tài)，促進細胞存活[6-8]。大量臨床研究證實，自噬參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程[9]。研究顯示，Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)過表達的小鼠心肌細胞中自噬活動增加，心功能降低，LC3是哺乳動物細胞中酵母Atg8基因的同源物，被認為是自噬小體的標志分子[10]。本實驗觀察了自噬與缺血性心肌病的關系，發(fā)現Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表達明顯增加，證明自噬與缺血性心肌病有重要關系。

綜合文獻報道及本實驗結果，可以推測缺血缺氧引發(fā)心肌細胞內質網應激，內質網應激導致細胞自噬增加，吞噬受損的線粒體及清除內質網未折疊蛋白，幫助細胞穩(wěn)態(tài)的恢復，促進心肌細胞存活。但在心肌細胞缺血缺氧時，內質網應激與自噬哪一個是啟動因子以及具體觸發(fā)機制目前尚不清楚，有待于在以后的實驗中明確。