孫 超 黃維芝 孫俊梅 李曉菲 湯連升

(1.山東省藥學(xué)科學(xué)院山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250101)(2.山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院，煙臺(tái) 264199)

隨著臨床對(duì)兒科用藥安全理念的加強(qiáng)，兒科藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)和幼齡動(dòng)物相關(guān)試驗(yàn)越來(lái)越受到重視。嬰、幼兒期是一個(gè)不斷發(fā)育成長(zhǎng)的過(guò)程，在生長(zhǎng)的不同階段擁有不同的體征，對(duì)藥物作用的反饋也存在一定的差異，同樣不同發(fā)育階段的幼齡大鼠對(duì)于藥物的不良反應(yīng)以及毒性表征亦存在差異[1-2]。不同區(qū)域或者GLP條件下成年SD大鼠生物學(xué)指標(biāo)文獻(xiàn)報(bào)道較多[3-4]，但GLP條件幼齡大鼠尚無(wú)建立一套完整的、規(guī)范的血液學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)背景數(shù)據(jù)[5-6]，本研究在幼齡大鼠的不同發(fā)育時(shí)間段，對(duì)大鼠的血生化指標(biāo)及血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行采集分析，探究不同發(fā)育階段對(duì)血液指標(biāo)影響，以期構(gòu)建本中心幼齡大鼠的背景數(shù)據(jù)，用于試驗(yàn)結(jié)果異常數(shù)據(jù)的解釋。

1 材料與方法

1.1 試劑和主要儀器

戊巴比妥鈉，由濟(jì)南億歐生物科技有限公司分裝提供；SYSMEX XT-2000IV型全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀，Sysmex Corporation生產(chǎn)；SYSMEX CA1500全自動(dòng)血凝分析儀，Sysmex Corporation生產(chǎn)；日立7180全自動(dòng)生化分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)生產(chǎn)；SPF級(jí)大、小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)。

1.2 動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

取成年性成熟健康SD大鼠60只(用于繁殖幼齡SD大鼠)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2012-0001。60只幼齡大鼠來(lái)源于不同窩別，雌雄各半，飼養(yǎng)于中心SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(魯)2014 0008。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)間控制溫度20～26 ℃，日溫差≤4 ℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)至少8次/h；每籠1只飼養(yǎng)于放有墊料的透明大鼠飼養(yǎng)盒(籠盒尺寸≥500 mm×360 mm×200 mm)，用SPF大小鼠生長(zhǎng)繁殖飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。

1.3 動(dòng)物分組

將成年雄鼠與雌鼠1∶1合籠，分娩后第4天根據(jù)健康狀況每窩留取雌、雄胎鼠各半，分娩后第15天按照胎鼠體質(zhì)量隨機(jī)分成6、12和16周齡組，每組動(dòng)物20只，雌雄各10只。幼齡大鼠6、12和16周齡分別相當(dāng)于人類(lèi)兒童、青少年和成年時(shí)期，大體覆蓋了機(jī)體發(fā)育特征顯著的三個(gè)時(shí)間段[7-9]。

1.4 生物樣本的收集和檢測(cè)

相應(yīng)組別分別于6、12和16周齡時(shí)禁食12 h，按照40 mg/kg體質(zhì)量劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉后腹主動(dòng)脈取血[10]，然后分別置于添加EDTAK2、枸櫞酸鈉和促凝劑的一次性負(fù)壓采血管中，根據(jù)要求處理后置于Sysmex XT-2000iv全自動(dòng)血液分析儀、SYSMEX CA1500全自動(dòng)血凝分析儀和日立7180全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算各測(cè)定指標(biāo)參數(shù)的平均值和95%的置信區(qū)間，采用SPSS18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 幼齡大鼠血常規(guī)及凝血主要指標(biāo)的測(cè)定與分析

參見(jiàn)表1、2，結(jié)果顯示不同周齡間雌性幼鼠的WBC、PLT、APTT、TT和Fbg指標(biāo)以及雄性幼鼠的LYNPH%、Fbg指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。6 周齡組的血常規(guī)和凝血指標(biāo)多數(shù)指標(biāo)與12 周齡和16 周齡組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)；12 周齡組僅個(gè)別指標(biāo)與16 周齡組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明：幼齡SD大鼠前期發(fā)育階段的血常規(guī)及凝血指標(biāo)與成年時(shí)期的SD大鼠指標(biāo)具有一定差異性。

數(shù)據(jù)分析表明雌雄幼鼠的大部分血常規(guī)及凝血指標(biāo)呈現(xiàn)一定的時(shí)間相關(guān)性；12 周齡和16周齡幼鼠的RBC、PLT、HGB指標(biāo)與6周齡幼鼠相比均出現(xiàn)明顯升高現(xiàn)象，個(gè)別數(shù)據(jù)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是亦有升高趨勢(shì)；NEUT和EO比例隨著幼鼠周齡的增加呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而MONO比例則出現(xiàn)降低趨勢(shì)。12周齡和16周齡幼鼠的RET細(xì)胞數(shù)與6周齡幼鼠相比均出現(xiàn)明顯降低現(xiàn)象。凝血方面雄性6周齡幼鼠APTT指標(biāo)出現(xiàn)極顯著性降低，其他6周齡幼鼠部分指標(biāo)與12周齡、16周齡組相比雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是各組的平均值差別不大，無(wú)太明顯的離散性。12周齡幼鼠和16周齡大鼠比較，僅個(gè)別指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其余指標(biāo)均無(wú)明顯差異。通過(guò)對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的分析判斷，處于兒童時(shí)期的SD幼鼠的血常規(guī)和凝血指標(biāo)與青少年、成年時(shí)期相比有一定的差異性，值得進(jìn)一步探究，而處于青少年時(shí)期的SD大鼠和成年期的指標(biāo)參數(shù)基本一致，數(shù)據(jù)無(wú)明顯的離散性；該發(fā)現(xiàn)對(duì)今后幼鼠試驗(yàn)有一定的參考價(jià)值。

表1 雌性幼齡大鼠血常規(guī)及凝血指標(biāo)數(shù)據(jù)Table 1 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Female Rats

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

2.2 幼齡大鼠血生化主要指標(biāo)背景數(shù)據(jù)的測(cè)定與分析

結(jié)果參見(jiàn)表3、4，雌性幼鼠的ALT、TC、TG不同周齡間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；雄性幼鼠的ALT、AST、TBIL、TG、CK不同周齡間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。雌雄幼鼠6周齡組的血生化指標(biāo)大部分?jǐn)?shù)據(jù)與12周齡、16周齡組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)，而12周齡組僅個(gè)別血生化指標(biāo)與16周齡組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。表明幼齡SD大鼠的血生化指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)是有所差異的。

通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)雌、雄幼鼠的大部分血生化指標(biāo)具有一定的時(shí)間相關(guān)性，且相關(guān)性無(wú)明顯性別差異；雌、雄幼鼠ALP、A/G均呈時(shí)間負(fù)相關(guān)性，TP、TBIL、GLU、BUN、Crea均呈時(shí)間正相關(guān)性。12周齡幼鼠和16周齡大鼠的ALP、A/G指標(biāo)與6周齡幼鼠相比均有明顯降低現(xiàn)象。12周齡和16周齡組的TP、TBIL、GLU、BUN、Crea指標(biāo)與6周齡幼鼠相比均有明顯升高現(xiàn)象，個(gè)別數(shù)據(jù)雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是亦有升高趨勢(shì)。12周齡幼鼠和16周齡大鼠比較，除個(gè)別指標(biāo)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外其余指標(biāo)均無(wú)明顯差異。通過(guò)對(duì)以上統(tǒng)計(jì)結(jié)果的分析判斷，SD大鼠兒童時(shí)期的血生化指標(biāo)與青少年、成年時(shí)期相比差異性比較明顯，而SD大鼠青少年時(shí)期與成年時(shí)期相比基本無(wú)明顯差別。

表2 雄性幼齡大鼠血常規(guī)及凝血指標(biāo)數(shù)據(jù)Table 2 Blood Routine and Coagulation Index Data of Young Male Rats

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

表3 雌性幼齡大鼠血生化指標(biāo)數(shù)據(jù)Table 3 Blood Biochemical Index Data of Female Young Rat

注：6周齡、12周齡組與16周齡組比較*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，##P<0.01

表4 雄性幼齡大鼠血生化指標(biāo)數(shù)據(jù)Table 4 Blood Biochemical Index Data of Male Young Rat

注：6周齡、*P<0.05，**P<0.01，6周齡組與12周齡組比較#P<0.05，##P<0.01
Note:The comparison between 6 weeks old group、12 weeks old group and 16 weeks old group，*P<0.05，**P<0.01；The comparison between 12 weeks old group and 16 weeks old group，#P<0.05，##P<0.01

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)和血生化指標(biāo)是藥效、新藥評(píng)價(jià)試驗(yàn)的基礎(chǔ)指標(biāo)，這些基礎(chǔ)指標(biāo)在幼齡動(dòng)物中尤其匱乏。本次試驗(yàn)得到了本試驗(yàn)室不同時(shí)間段幼齡SD大鼠的血液學(xué)和血清生化學(xué)常用檢測(cè)指標(biāo)的正常生理波動(dòng)的大體范圍，初步建立了相應(yīng)的背景數(shù)據(jù)，為本中心開(kāi)展兒科藥物的非臨床安全性評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支持。所得數(shù)據(jù)與部分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11-13]基本相近，但也存在一定的差異性，初步估計(jì)是可能主要由于采集血液樣本的動(dòng)物周齡階段不同所引起的。從本次研究結(jié)果可知，相對(duì)于12周齡幼鼠，6周齡幼齡大鼠血液指標(biāo)與16周齡成年大鼠相比有明顯的差異，推測(cè)可能周齡越小幼鼠的血液學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)較成年動(dòng)物的差異性會(huì)更明顯，這應(yīng)與幼齡時(shí)期機(jī)體的發(fā)育正處于旺盛階段有必然的聯(lián)系。

目前的試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本建立了本中心幼齡SD大鼠不同發(fā)育階段的血液學(xué)和血清生化學(xué)數(shù)據(jù)參考范圍，可初步用于本中心血液學(xué)結(jié)果的合理解釋。資料顯示幼齡犬標(biāo)準(zhǔn)血液學(xué)參數(shù)指標(biāo)從出生到青春期有一些特殊的差異[14]，本試驗(yàn)研究結(jié)果表明幼齡大鼠亦存在一定的差異。但是，由于受到樣本量的限制，尚未建立全面完善的幼齡大鼠血液指標(biāo)的背景數(shù)據(jù)，在此希望各實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心或研究中心逐步采集和分享幼齡大鼠血液指標(biāo)的相關(guān)數(shù)據(jù)，以期建全幼齡大鼠血液學(xué)參考范圍，為今后開(kāi)展幼齡大鼠試驗(yàn)的血液學(xué)和血清生化學(xué)數(shù)據(jù)分析提供參考范圍，為正常生物學(xué)變異和兒科新藥的藥效作用判斷提供參考。