王 吉 付 瑞 李曉波 王淑菁 王莎莎 李 威 秦 驍 黃宗文 鞏 薇 岳秉飛 賀爭(zhēng)鳴

(中國(guó)食品藥品檢定研究院 國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物遺傳檢測(cè)中心，北京 100050)

牛皰疹病毒I型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)主要引起牛傳染性鼻氣管炎，又稱牛傳染性鼻氣管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)。BHV-1屬皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科[1-3]。BHV-1感染又稱紅鼻病或牛傳染性壞死性鼻炎，是一種急性接觸性傳染病，臨床特征為呼吸困難和發(fā)熱，有鼻炎、鼻竇炎、喉炎和氣管炎為特征[4-7]。除能引起呼吸道疾病外，還可引起結(jié)膜炎、流產(chǎn)、腦炎和全身性感染[8-9]。OIE將其列為(通報(bào)疾病)B類疫病，在我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病，是我國(guó)進(jìn)出境動(dòng)物和國(guó)際動(dòng)物貿(mào)易中規(guī)定的重點(diǎn)檢疫對(duì)象[10-11]。病毒主要存在于鼻、眼、陰道分泌物和排泄物中[12-13]。本病主要由飛沫經(jīng)呼吸道傳播，吸血昆蟲(chóng)(軟殼蜱等)也可傳播本病。在自然條件下，各種年齡和品種的牛均易感，一般發(fā)病率為20%～100%，死亡率為1%～12%[2，14-15]。在國(guó)內(nèi)外的養(yǎng)牛場(chǎng)廣泛流行,大部分省份的奶牛、肉牛、牦牛等均有不同程度感染,是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染病[11，16]。

隨著牛源性生物制品開(kāi)發(fā)利用的日益增多，人們對(duì)牛源性制品是否潛在病毒污染，對(duì)潛在病毒是否會(huì)通過(guò)直接或間接途徑對(duì)人造成危害或者傳染病的擴(kuò)散也越來(lái)越關(guān)注[17]。為保障人民用藥的安全及避免傳染病的擴(kuò)散，最大限度地降低使用牛源性生物制品而引起牛皰疹病毒1型傳播的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)驗(yàn)建立了特異、敏感，操作快速、簡(jiǎn)便的BHV-1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于開(kāi)展對(duì)牛及人用牛源性生物制品及原輔材料可能潛在的BHV-1 的檢測(cè)，對(duì)保證牛源性材料及牛源性制品的使用安全性、保障人民的用藥安全至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品

牛皰疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)、牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)、牛病毒性腹瀉病毒1型(Bovine viral diarrhea virus type 1，BVDV1)、貓皰疹病毒Ⅰ型(Felid herpesvirus 1，F(xiàn)HV-1)購(gòu)自美國(guó)ATCC(編號(hào)分別為VR-188、VR-281、VR-1422、VR-636)；豬偽狂犬病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、單純皰疹病毒Ⅰ型(Herpes simplex virus 1，HSV-1)：本室保存；BHV-1 pGEM-T Easy-pol質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：委托寶生物工程(大連)有限公司合成；145份牛血漿樣本(編號(hào)分別為X1～X145)：來(lái)自內(nèi)蒙古自治區(qū)某奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)和北京市某奶牛和肉牛飼養(yǎng)單位；36批次人用牛源樣本(編號(hào)：Ny1-Ny36)：國(guó)內(nèi)7省市11個(gè)廠家和國(guó)外2個(gè)廠家提供。

1.2 主要試劑及主要儀器

RNA快速提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司；TaqMan Gene Expression Master Mix：美國(guó)ABI公司；PCR儀：美國(guó)Bio-RAD公司；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國(guó)Bio-RAD公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國(guó) Kodak公司 GL212Pro；熒光定量PCR儀：美國(guó)Applied Biosystems公司7500fast Real-Time PCR System。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)合成

分析已報(bào)道的BHV-1基因組序列，將不同株進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)GenBank中登陸的BHV-1gB基因(序列號(hào)：AJ004801.1)，采用ABI PrimerExpress 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成TaqMan探針及引物。探針的熒光標(biāo)記選擇FAM(5’端)作為報(bào)告發(fā)光基團(tuán),NFQ(3’端)為淬滅基團(tuán)，引物和探針由美國(guó)ABI公司合成。序列如下(見(jiàn)表1)：

表1 用于擴(kuò)增gB基因的引物與TaqMan探針序列Table 1 The sequences of primers and TaqMan probes to used for amplification gB gene

1.4 病毒DNA/RNA提取

按照DNA/RNA快速提取試劑盒操作方法，對(duì)正常牛腎細(xì)胞(Bovine kidney cells，MDBK細(xì)胞)、BHV-1感染MDBK細(xì)胞毒、BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1進(jìn)行DNA/RNA提取。提取的DNA樣本凍存于-70 ℃冰箱備用。提取的RNA樣本立即進(jìn)行cDNA合成。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.5.1通過(guò)優(yōu)化在熒光定量PCR反應(yīng)體系中使用的探針和引物濃度，確定最佳反應(yīng)條件，建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法[18-20]。

在96孔板中按以下體系加樣，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)：

Mix10μL滅菌水8μL探針+引物1μLDNA1μL總體積20μL

反應(yīng)條件為：先50 ℃保持2 min；然后95 ℃預(yù)變性10 min；最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。

1.5.2用含有目的片段的BHV-1質(zhì)粒pGEM-T Easy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)公式copies /μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNA length×660)，算出BHV-1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。將其稀釋為108～100copies/μL凍存?zhèn)溆?。?07～102copies/μL作為模板按上述反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[18-19]。

1.6 特異性試驗(yàn)

分別以BHV-1感染MDBK細(xì)胞毒、BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1及正常MDBK細(xì)胞的DNA/cDNA為模板，用建立的Q-PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn)

取108～100copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品用建立的熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品各做3個(gè)復(fù)孔。所能檢測(cè)的最小濃度梯度的循環(huán)閾值(CT)≤35,拷貝數(shù)(copies)≥10時(shí),此濃度為方法的檢測(cè)靈敏度[17-18]。

1.8 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL 3個(gè)不同濃度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，用建立的方法分3個(gè)不同時(shí)間重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算批間變異系數(shù)，評(píng)價(jià)本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性[18-19]。

1.9 判斷標(biāo)準(zhǔn)的制定

建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope在-3～-3.5之間、R2大于或等于0.99、Eff%在90%～110%之間，實(shí)驗(yàn)成立可用于定量檢測(cè)。

樣品循環(huán)閾值(CT)≤35,同時(shí)拷貝數(shù)(copies)≥10,判定該樣品檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；循環(huán)閾值(CT)≤35、拷貝數(shù)(copies)<10，或者循環(huán)閾值(CT)>35、拷貝數(shù)(copies)≥10，或者循環(huán)閾值(CT)>35、拷貝數(shù)(copies)<10,此樣品超出檢測(cè)限，不能確定被檢樣品是陽(yáng)性樣品，結(jié)果判為陰性[18-19]。

(3)智慧城市市民抱怨、智慧城市預(yù)期與智慧城市建設(shè)滿意度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)得到驗(yàn)證(H5，H6)，且在0.05水平下是顯著的。這表明較高的市民期望值會(huì)對(duì)智慧城市的建設(shè)發(fā)展產(chǎn)生些許的負(fù)面影響，如果市民對(duì)智慧城市建設(shè)的期望太高，市民在享受服務(wù)之后的實(shí)際心理感知與期望值相比差距較大，那么市民的滿足性預(yù)期得不到滿足，市民對(duì)智慧城市建設(shè)的抱怨就會(huì)增多，因而降低了市民的滿意度。

1.10 應(yīng)用

1.10.1取145份牛血漿樣本(編號(hào)為X1～X145)按照DNA快速提取試劑盒操作方法提取樣本DNA，同時(shí)設(shè)BHV-1、正常MDBK細(xì)胞對(duì)照。用建立的方法分2次對(duì)10倍稀釋的145份血漿樣本DNA進(jìn)行檢測(cè)。

1.10.2取36批次人用牛源生物制品及人用牛源生物制品生產(chǎn)用原材料樣本(編號(hào)：Ny1～Ny36)按1.10.1方法進(jìn)行檢測(cè)。36批次牛源生物制品及原材料具體信息見(jiàn)表2。

表2 36批次牛源樣本信息Table 2 The information of 36 bovine origin samples

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)控品的制備

經(jīng)拷貝數(shù)計(jì)算公式copies/μL=(6.02×1023)×(ng/μL×10-9)/(DNAlength×660)計(jì)算，BHV-1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品原濃度分別為1.12×1011copies/μL。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

用含有目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，分別設(shè)為1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies /μL，作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。擴(kuò)增曲線各稀釋梯度間距均勻，線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線各參數(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1。

結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Slope(應(yīng)在-3～-3.5之間)、R2值(應(yīng)≥0.99)，擴(kuò)增效率Eff%(應(yīng)在90%～110%之間)均優(yōu)于Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍，說(shuō)明建立的方法相關(guān)性高，定量結(jié)果有效，可用于BHV-1的定量檢測(cè)。

圖1 1×107～1×101 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The amplification curve of 1×107-1×101 copies/μL standard

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如圖2所示，BHV-1感染MDBK細(xì)胞毒有明顯擴(kuò)增曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)符合要求的條件下，其循環(huán)閾值CT值為24.721，拷貝數(shù)為2.42×104copies/μL，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。BPIV3、BVDV1、PRV、FHV-1、HSV-1及正常MDBK細(xì)胞無(wú)曲線擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。說(shuō)明所建方法特異性良好。

圖2 BHV-1 Q-PCR特異性檢測(cè)結(jié)果注：1：BHV-1；2～7：BPIV3、BVDV1、FHV-1、PRV、HSV-1、MDBK細(xì)胞Fig.2 Specific test results of BHV-1 Q-PCRNote：1:BHV-1;2-7:BPIV3,BVDV1,FHV-1,PRV,HSV-1,MDBK cell

2.4 熒光定量PCR檢測(cè)方法靈敏度檢測(cè)

圖3、圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到1.0×101copies時(shí)有明顯擴(kuò)增曲線，CT值為32.139，實(shí)際檢測(cè)拷貝數(shù)為13.234copies，仍在可信范圍之內(nèi)；1.0×100copies時(shí)有擴(kuò)增曲線，CT值為35.539，拷貝數(shù)為0.772copies，已超出可信范圍。所以臨界稀釋度為1.0×101時(shí)，其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為10，因此最低檢測(cè)限度為10個(gè)copies。說(shuō)明建立的熒光定量PCR方法具有很高的靈敏度。

圖3 1×108～1×100 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of 1×108-1×100 copies/μL standard

圖4 1×108～1×100 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線Fig.4 The amplification curve of 1×108-1×100 copies/μL standard

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

起始濃度分別為1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品的最終實(shí)測(cè)值的均值分別為1.083×106、0.9248×105、0.9832×104copies/μL，對(duì)應(yīng)CTSD值及CV值見(jiàn)表3。3個(gè)濃度梯度3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)Ct值的變異系數(shù)(CV)均小于5%，表明方法重復(fù)性、穩(wěn)定性良好。

表3 熒光定量PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The repeatability and stability testing results of Q-PCR

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的應(yīng)用

2.6.1血漿樣本檢測(cè)結(jié)果

利用建立的方法，對(duì)145份牛血漿樣本(編號(hào)分別為X1～X145)分2次進(jìn)行檢測(cè)。第1次檢測(cè)前64份血漿樣本(編號(hào)X1～X64),第2次檢測(cè)后81份血漿樣本(編號(hào)X65～X145)。

在標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)符合要求、陰陽(yáng)對(duì)照成立的條件下，依據(jù)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示有6份牛血漿樣本(X9、X10、X121、X133、X135、X145)BHV-1核酸陽(yáng)性。其他139份樣本均為陰性。145份牛血漿樣本檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率為4.14%(6/145)。

表4 熒光定量PCR方法檢測(cè)145份血漿樣本陽(yáng)性結(jié)果Table 4 The positive results of Q-PCR to detect 145 plasma samples

樣本X1～X64的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖5，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖見(jiàn)圖6；樣本X65～X145的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖7，相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線圖略。2次檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表5。

圖5 64份(X1～X64)血漿樣本擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplification curve of 64 plasma samples

圖6 檢測(cè)64份血漿樣本的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig.6 The standard amplification curve of detection 64 plasma samples

圖7 81份(X65～X145)血漿樣本擴(kuò)增曲線Fig.7 The amplification curve of 81 plasma samples

2.5.2牛源性樣本檢測(cè)結(jié)果

在標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)符合要求、陰陽(yáng)對(duì)照成立的條件下，結(jié)果顯示36份牛源性樣本均為陰性，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖8，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增曲線圖略。標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見(jiàn)表5。

圖8 36份牛源性樣本擴(kuò)增曲線Fig.8 The standard amplification curve of 36 bovine origin samples

表5 3次樣本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)Table 5 The results of Q-PCR to detect positive samples

從表5中可以看出3次樣本檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)Slope均在-3～-3.5之間、R2值均≥0.99、擴(kuò)增效率Eff%均在90%～110%之間，說(shuō)明3次檢測(cè)結(jié)果定量有效。

3 討論

牛鼻氣管炎病(皰疹病毒Ⅰ型感染)OIE將其列為(通報(bào)疾病)B類疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[9-10]，其傳播范圍廣，危害大。目前國(guó)內(nèi)外雖已建立了多種檢測(cè)方法，包括血清學(xué)及PCR檢測(cè)方法等[5-6，9-11,17，21-23]，但未見(jiàn)有針對(duì)牛源性制品及牛源制品原輔材料外源BHV-1 檢測(cè)的報(bào)道，中國(guó)藥典亦沒(méi)有關(guān)于牛源制品及原輔材料檢測(cè)的規(guī)定[24]。中國(guó)藥典在“新生小牛血清檢測(cè)”中雖然有關(guān)于新生牛血清用細(xì)胞接種法和免疫熒光法檢測(cè)病毒的規(guī)定，但沒(méi)有更為敏感特異的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，針對(duì)人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測(cè)目前在我國(guó)還幾乎是空白[17]。

實(shí)驗(yàn)室在建立BHV-1 PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上[17]，建立了操作更為簡(jiǎn)便、特異、敏感的BHV-1熒光定量PCR檢測(cè)方法。其目的主要是用于牛及牛源性材料、人用牛源性生物制品潛在污染BHV-1的檢測(cè)。如小牛血清去蛋白注射液、牛肉浸液、牛膽膏、牛骨粉、牛骨源性明膠，及其用于生產(chǎn)上述制品的原材料牛血漿、牛組織等，均可能攜帶外源BHV-1。制品或原材料攜帶的病原體及其代謝產(chǎn)物可能直接感染人或動(dòng)物引起人和動(dòng)物本身的危害，或者通過(guò)制品或原材料污染傳播疾病，導(dǎo)致傳染性疾病的流行爆發(fā)，或病毒核酸或蛋白可能導(dǎo)致免疫抑制、退行性病變或癌基因的活化等潛在危害[17]。

實(shí)驗(yàn)雖然沒(méi)有從國(guó)內(nèi)11個(gè)廠家和國(guó)外2個(gè)廠家的36份牛源性制品及生產(chǎn)制品的原材料血漿中檢測(cè)出BHV-1，但是通過(guò)對(duì)來(lái)自內(nèi)蒙古某飼養(yǎng)場(chǎng)和北京某飼養(yǎng)單位的牛血漿進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2家單位的牛均有BHV-1感染，而且實(shí)驗(yàn)室之前通過(guò)PCR方法也從2家單位的牛樣本中檢測(cè)到BHV-1[17]。我們不僅證明了建立的方法確實(shí)可以用于牛及牛源樣本BHV-1感染的檢測(cè)，同時(shí)也證明用于牛源制品生產(chǎn)的原材料血漿中確實(shí)存在BHV-1的污染可能，無(wú)疑會(huì)給人民用藥及傳染病的傳播帶來(lái)潛在的風(fēng)險(xiǎn)。甚至有報(bào)道從BHV-1自然感染的牛的牛奶中檢測(cè)到BHV-1[15]，因此本實(shí)驗(yàn)室建立的方法不僅可以用于牛源生物制品及原輔材料的檢測(cè)，還可用于牛奶等牛源性食品的檢測(cè)，以保障牛源性食品的安全，防止牛鼻氣管炎病的傳播與擴(kuò)散。

實(shí)驗(yàn)通過(guò)敏感性、特異性、重復(fù)性、穩(wěn)定性方法學(xué)評(píng)價(jià)，證明建立的方法可用于牛及牛源性生物制品及其原輔材料攜帶外源病毒的檢測(cè)，填補(bǔ)了我國(guó)在牛源生物制品檢測(cè)技術(shù)方面的空白，為試劑盒的研發(fā)及檢測(cè)技術(shù)的推廣奠定了基礎(chǔ)，為在全國(guó)范圍內(nèi)推動(dòng)牛源制品及原輔材料外源BHV-1檢測(cè)提供了技術(shù)支撐，同時(shí)也為制定牛源生物制品外源病毒檢測(cè)技術(shù)操作規(guī)程和相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。