杜 凱 李文光 吳德國(guó) 趙德明

(1.中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所,北京 100101)(2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),北京 100094)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是相關(guān)科學(xué)研究重要的、不可或缺的實(shí)驗(yàn)材料，動(dòng)物的質(zhì)量可直接反映出科研水平的高低[1]。小鼠巨細(xì)胞病毒可導(dǎo)致小鼠肺炎，感覺(jué)神經(jīng)性耳聾，眼內(nèi)感染，心臟感染(心包心肌炎、營(yíng)養(yǎng)不良性心臟鈣化，皮膚感染皰疹)，腦炎，肝炎等[2-4]，對(duì)毒理學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)等試驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生影響。因此，從事相關(guān)試驗(yàn)研究使用的小鼠需要排除小鼠巨細(xì)胞病毒的感染。

1 材料與方法

1.1 小鼠來(lái)源

結(jié)扎鼠、供體鼠、受體鼠來(lái)源于遺傳發(fā)育所動(dòng)物中心。待凈化鼠：C57小鼠,經(jīng)檢測(cè)種群感染小鼠巨細(xì)胞病毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

PMSG、hCG分別購(gòu)自寧波第二激素廠和SIGMA公司，M2操作液、M16培養(yǎng)液和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自SIGMA公司。

1.3 方法

1.3.1結(jié)扎雄鼠的準(zhǔn)備：雙側(cè)輸精管結(jié)扎雄鼠。手術(shù)1周后，與雌鼠交配，見(jiàn)到陰道栓的雌鼠未懷孕，證明雄鼠結(jié)扎成功，可使用。使用時(shí)，做好見(jiàn)栓記錄，連續(xù)4～6次不見(jiàn)栓的結(jié)扎鼠以二氧化碳吸入法[5]淘汰處死。

1.3.2供體鼠的超排處理：雌鼠在實(shí)驗(yàn)第1天下午16時(shí)腹腔注射PMSG，第3天下午16時(shí)腹腔注射hCG。注射hCG后，1只雌鼠與1只雄鼠進(jìn)行合籠。第4天上午8時(shí)檢查雌鼠陰道是否有栓塞，見(jiàn)栓的鼠作為供體。

1.3.3受體的同期發(fā)情處理：假孕雌鼠是通過(guò)用結(jié)扎雄鼠與受體鼠交配得到的。第3天下午16時(shí)，結(jié)扎雄鼠與受體鼠合籠交配。

1.3.4胚胎采集、沖洗：在實(shí)驗(yàn)的第5天，通過(guò)脫頸法處死供體雌鼠，用70%的酒精噴灑腹部，使用眼科剪在腹部中間剪開(kāi)一個(gè)小口。眼科鑷夾住剪開(kāi)的皮膚，向頭尾部拉伸使毛發(fā)脫離腹腔.。眼科剪剪開(kāi)腹膜，取出輸卵管、子宮，轉(zhuǎn)移到裝有M2的平皿上。注射器吸取沖胚液，將胚胎沖出。使用移卵管將胚胎收集起來(lái)，轉(zhuǎn)移到含新鮮M2的培養(yǎng)液中，反復(fù)洗幾次。將胚胎轉(zhuǎn)移至微滴培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液清洗，37 ℃、5%二氧化碳的條件培養(yǎng)暫存。

1.3.5品質(zhì)鑒定：在胚胎保存液中將胚胎清洗2～3次后，放于顯微鏡下觀察，品質(zhì)鑒定分為優(yōu)良胚胎、普通胚胎、不良胚胎和不可用胚胎，其中優(yōu)良胚胎和普通胚胎為可用胚胎。

1.3.6胚胎移植：交配后0.5～3.5 d的單細(xì)胞發(fā)育到囊胚階段的胚胎，可以移植到假孕雌鼠的生殖道內(nèi)使其繼續(xù)發(fā)育。1.5 d的胚胎可以移植到假孕1.5 d小鼠的輸卵管壺腹部，而3.5 d的胚胎可以移植到2.5 d或3.5 d假孕雌鼠的子宮內(nèi)。

1.3.7檢測(cè):受體鼠產(chǎn)仔后，利用已報(bào)道的小鼠巨細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)方法[6]進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 試驗(yàn)

1.4.1不同廠商激素的對(duì)比試驗(yàn):按照1.3.2介紹的超排方法進(jìn)行，使用不同廠商、不同劑量的激素進(jìn)行超排處理，對(duì)比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占到總胚胎數(shù)量的比率。選取的兩家PMSG、HCG廠家為：SIGMA、寧波第二激素廠。劑量分別選取5、7.5、10IU。

1.4.2小鼠不同發(fā)情周期注射激素的對(duì)比試驗(yàn):選取不同發(fā)情周期的供體小鼠注射PMSG，后續(xù)超排按照1.3.2方法進(jìn)行，對(duì)比超排出受精卵的數(shù)量，用以確定選取哪個(gè)發(fā)情周期的小鼠進(jìn)行超排處理。

1.4.3受體鼠品系的對(duì)比試驗(yàn):選取C57、ICR、C57雄性與ICR雌性交配的子一代(CIF1代)以及C57雌性與ICR雄性交配的子一代(ICF1代)作為受體鼠，利用輸卵管移植法移植C57小鼠2細(xì)胞的胚胎，雙側(cè)輸卵管移植，移植相同數(shù)量的胚胎，對(duì)比仔鼠出生后的移植率。

1.4.4輸卵管移植與子宮移植產(chǎn)仔率的對(duì)比試驗(yàn):選取C57小鼠，隨機(jī)分成兩組。分別進(jìn)行輸卵管移植和子宮移植，均進(jìn)行雙側(cè)移植。產(chǎn)仔后計(jì)算產(chǎn)仔數(shù)量，得出產(chǎn)仔率。

1.4.5不同時(shí)期胚胎通過(guò)輸卵管移植的成功率試驗(yàn):采集的C57小鼠的單細(xì)胞、2細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎，進(jìn)行輸卵管移植，移植到ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，觀察受體鼠的妊娠率，用以評(píng)價(jià)不同時(shí)期的胚胎對(duì)輸卵管移植成功率的影響。

1.4.6輸卵管移植移植胚胎數(shù)量的對(duì)比試驗(yàn):選取品質(zhì)在優(yōu)良、正常的2細(xì)胞胚胎，移植到受體鼠的輸卵管內(nèi)，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，觀察受體鼠的產(chǎn)仔率，用以評(píng)價(jià)移植胚胎數(shù)目的不同對(duì)輸卵管移植效果的影響。

2 結(jié)果

2.1 不同廠商激素的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

按照1.3.2介紹的方法分別對(duì)8周C57小鼠60只使用不同廠商、不同劑量的激素進(jìn)行超排處理，對(duì)比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占到總胚胎數(shù)量的比率。由表1可知，使用SIGMA生產(chǎn)的激素超排效果無(wú)論從可用胚胎數(shù)和可用胚胎比率看，均明顯優(yōu)于寧波第二激素廠。SIGMA產(chǎn)激素超排不同劑量間可用胚胎比率差別不大，使用10IU劑量超排C57小鼠的優(yōu)良、正常胚胎數(shù)約17枚/只。

表1 不同廠商不同劑量的激素對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of different hormones in different manufacturers

2.2 小鼠不同發(fā)情周期注射激素的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

每組分別選取10只發(fā)情間期、發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期8周的C57小鼠，按照1.3.2介紹的方法進(jìn)行超排處理，SIGMA產(chǎn)激素使用10IU，對(duì)比得到的胚胎數(shù)量，以及優(yōu)良胚胎和正常胚胎占總胚胎數(shù)量的比率。由表2可知，在小鼠的發(fā)情間期超排，得到的優(yōu)良、正常胚胎數(shù)量最多，平均每只小鼠獲得約23枚胚胎。

表2 不同發(fā)情周期注射激素的對(duì)比結(jié)果Table 2 Results of injection hormones in different estrous cycles

2.3 受體鼠品系的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

選取8周的C57、ICR、CIF1代和ICF1代的受體鼠，采用輸卵管移植方法，雙側(cè)輸卵管移植，移植25枚2細(xì)胞胚胎，待仔鼠出生后計(jì)算產(chǎn)仔數(shù)量，得出4種不同品系的小鼠的產(chǎn)仔率分別為37.5%、42%、44.5%和43.5%。由表3可知，CIF1代小鼠作為受體產(chǎn)仔率較高。

表3 受體鼠品系的對(duì)比結(jié)果Table 3 Results of recipient mouse strains

2.4 輸卵管移植與子宮移植產(chǎn)仔率對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

選取17只ICR小鼠，隨機(jī)分成兩組，分別進(jìn)行輸卵管移植和子宮移植，均進(jìn)行雙側(cè)移植，其中輸卵管移植ICR母鼠10只共移植251枚優(yōu)良、正常胚胎，子宮移植受體母鼠7只共移植211枚C57小鼠胚胎。由表4可知，輸卵管移植和子宮移植分別產(chǎn)仔102只、58只，產(chǎn)仔率分別為40.64%、27.49%。

表4 不同移植方法產(chǎn)仔率對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of different transplantation methods in birth rate

2.5 不同時(shí)期胚胎通過(guò)輸卵管移植的成功率試驗(yàn)結(jié)果

采集C57小鼠的單細(xì)胞、2細(xì)胞和8細(xì)胞胚胎，進(jìn)行輸卵管移植，移植到ICR母鼠的輸卵管內(nèi)，觀察受體鼠的妊娠率，由表5可知，移植2細(xì)胞胚胎的妊娠率最高，達(dá)到了80%，而移植單細(xì)胞和8細(xì)胞的妊娠率分別為50%和40%。

表5 移植不同時(shí)期胚胎的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of embryo transfer in different periods

2.6 輸卵管移植移植胚胎數(shù)量的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

選取品質(zhì)在優(yōu)良、正常的2細(xì)胞胚胎，移植到受體鼠的輸卵管內(nèi)，每只小鼠移植12、24、32枚胚胎，以觀察受體鼠的產(chǎn)仔率。由表6可知：當(dāng)受體鼠移植24枚胚胎時(shí)，產(chǎn)仔率最高達(dá)到了43.75%，而移植12、32枚胚胎的產(chǎn)仔率分別為37.5%和34.38%。

表6 移植數(shù)量的對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of different numbers of embryo transfer

2.7 仔鼠的檢測(cè)結(jié)果

仔鼠出生后，眼角靜脈叢采集抗凝血。利用小鼠巨細(xì)胞病毒PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示均為陰性，見(jiàn)圖1。說(shuō)明感染小鼠巨細(xì)胞病毒的SPF級(jí)小鼠，經(jīng)過(guò)建立優(yōu)化的胚胎移植凈化方法，成功排除了小鼠巨細(xì)胞病毒的感染。

圖1 PCR檢測(cè)結(jié)果注：M:D2000 Marker;1:陽(yáng)性對(duì)照;2:陰性對(duì)照;3:樣品1;4:樣品2;5:樣品3;6:樣品4;7:樣品5Fig.1 Results of PCRNote：M:D2000 Marker;1:Positive control;2:Negative control;3:Sample1;4:Sample2;5:Sample3;6:Sample4;7:Sample5

3 討論

用于小鼠凈化的方法主要為藥物凈化、剖腹產(chǎn)凈化和胚胎移植凈化[7-9]。藥物凈化有一定的作用[10]，凈化不理想，難以達(dá)到目的。剖腹產(chǎn)凈化主要難點(diǎn)在于較難判斷母鼠的妊娠期，而且仔鼠的氣味會(huì)影響其代乳過(guò)程中的存活和育成，有的病毒(如淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒)可通過(guò)胎盤造成凈化的失敗。胚胎移植技術(shù)逐漸受到試驗(yàn)人員的重視。小鼠的胚胎透明帶可形成一道天然的屏障，能有效地抵御細(xì)菌、病毒的侵入[11]，能通過(guò)胎盤屏障的病原體也不能穿透透明帶，且胚胎在供體鼠體內(nèi)時(shí)間很短，也有效降低了母子間垂直傳播的可能性，同時(shí)在胚胎移植過(guò)程中的沖洗步驟還能有效減弱或消除病原體的活力[12]，這些極大地增加了對(duì)病原體凈化的有效性，為排除小鼠巨細(xì)胞病毒奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[13]。

本文利用優(yōu)化的胚胎移植凈化技術(shù)對(duì)感染了小鼠巨細(xì)胞病毒的SPF級(jí)小鼠進(jìn)行了胚胎移植凈化，獲得了無(wú)小鼠巨細(xì)胞病毒感染的SPF級(jí)小鼠。