莫 毅 劉 超 崔士龍 李 冰 蘇立波 李云娟 王 娟 乃東紅 謝 英

(1.廣西壯族自治區(qū)計(jì)劃生育研究中心科教科，南寧 530021)(2.河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，石家莊 050017)(3.廣西壯族自治區(qū)計(jì)劃生育研究中心臨床科，南寧 530021)

卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)是由于在體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期中對(duì)不孕不育患者進(jìn)行誘發(fā)排卵而引發(fā)的一種醫(yī)源性并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命[1]。OHSS的臨床表現(xiàn)包括卵巢腫大、腹水、惡心、嘔吐、電解質(zhì)紊亂、低血容量、少尿、腎功能衰竭、胸腔積液、血液栓塞等。OHSS的標(biāo)志性病理生理改變就是毛細(xì)血管通透性增加，從而導(dǎo)致嚴(yán)重滲出、卵巢體積增大、腹水、胸水、心包積液；而低血容量則引起少尿、血液濃縮導(dǎo)致血栓形成，進(jìn)一步引起腎衰、急性呼吸窘迫綜合征，甚至導(dǎo)致死亡[2-4]。研究數(shù)據(jù)顯示約有20%～30%的IVF患者會(huì)罹患輕度OHSS，重度OHSS的發(fā)生率則高達(dá)2%～3%。然而OHSS的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，因此在積極探尋OHSS有效預(yù)防和治療方法的同時(shí)，明確其發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要[5]。

動(dòng)物模型是醫(yī)學(xué)研究中用于理解疾病發(fā)生機(jī)制和探索藥物治療效果的一種非常重要的研究工具。目前OHSS小動(dòng)物模型以大鼠模型為主，3～5周齡的Wistar和SD大鼠均曾被用于OHSS大鼠模型的制備，但效果不一致[6-8]。本文將應(yīng)用不同品系和周齡的大鼠進(jìn)行OHSS模型的建立并進(jìn)行比較，以期為后續(xù)的OHSS發(fā)病機(jī)制研究及治療藥物的開發(fā)提供一種可靠穩(wěn)定的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3～5周齡SPF級(jí)雌性Wistar大鼠和雌性SD大鼠共60只，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(冀)-2018-008。動(dòng)物均飼養(yǎng)于屏障環(huán)境，自由飲食，室溫控制在22～24 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%，明暗周期12 h:12 h。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將動(dòng)物按品系和周齡分成4組，分別是4周齡wistar大鼠組、3周齡SD大鼠組、4周齡SD大鼠組、5周齡SD大鼠組。再將每組的15只動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，分作3個(gè)處理組，分別是過度刺激(OHSS)處理組、常規(guī)(mild OHSS)處理組和對(duì)照組(Control)。

1.3 主要試劑

伊文思藍(lán)購(gòu)自索萊寶科技有限公司，使用時(shí)用生理鹽水配制成5 mmol/L的溶液；注射用孕馬血清促性素(PMSG)、注射用人絨毛膜促性素(hCG)購(gòu)自寧波三生生物科技有限公司；孕激素、雌激素和VEGF ELISA試劑盒均購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司。

1.4 給藥方法

動(dòng)物分組的當(dāng)日定為第0天。第1～4日，過度刺激(OHSS)處理組和常規(guī)(mild OHSS)處理組均分別注射體積為0.2 mL的PMSG 10IU，對(duì)照組(Control)注射0.2 mL的生理鹽水；第5日，OHSS組注射30IU hCG，mild OHSS組注射10IU hCG，對(duì)照組注射0.2 mL的生理鹽水。注射hCG后的第48小時(shí)進(jìn)行樣品采集，具體實(shí)驗(yàn)日程安排見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理情況一覽表Table 1 Experimental animal experimental grouping and treatment

1.5 樣品采集

注射hCG后第48小時(shí)，稱取動(dòng)物體質(zhì)量并記錄，腹腔注射45 mg/kg體質(zhì)量的巴比妥進(jìn)行麻醉，內(nèi)眥采血。分離血清并置于-20 ℃保存。采血后，通過尾靜脈注射0.2 mL 5mmoL/L的伊文思藍(lán)溶液并于注射后30 min用5mL生理鹽水灌洗腹腔并收集灌洗液1 mL，在腹腔灌洗液中加入50 μL 0.1moL/L的NaOH溶液以清除蛋白質(zhì)造成的混濁。收集腹腔灌洗液后立即無菌打開腹腔，暴露卵巢，拍照，取出卵巢并稱其質(zhì)量。取出的卵巢稱其質(zhì)量后立即放入盛有4 mL二甲基甲酰胺的試管中，65 ℃水浴孵育24 h。收集的腹腔液和卵巢孵育液均在經(jīng)過900 g離心10 min后取上清檢測(cè)660 nm處的吸光度(A)。

1.6 血清雌二醇(E2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和孕酮(P)水平測(cè)定

分離得到的大鼠血清采用ELISA的方法進(jìn)行血清E2、VEGF和P水平測(cè)定，ELISA試劑盒購(gòu)自安徽巧伊生物科技有限公司，按說明書進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定相應(yīng)的吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS9.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，P<0.05則說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外觀觀察

通過解剖動(dòng)物后可以發(fā)現(xiàn)，全部4組經(jīng)過度刺激(OHSS)處理、常規(guī)刺激(mild OHSS)處理的動(dòng)物均可見明顯的卵巢體積增大。并且所有經(jīng)過度刺激處理(OHSS)的動(dòng)物腋下均可見明顯的毛細(xì)血管破裂并出現(xiàn)明顯斑塊(圖1)。

圖1 大體觀察Fig.1 The overall observation of ovary and subcutaneous hemorrhage

2.2 體質(zhì)量及各臟器質(zhì)量

各組的卵巢指數(shù)的分析結(jié)果顯示,全部4組經(jīng)過度刺激(OHSS)處理、常規(guī)刺激(mild OHSS)處理的動(dòng)物的卵巢指數(shù)均顯著高于對(duì)照組 (P<0.01)，且3周齡SD大鼠組經(jīng)常規(guī)刺激(mild OHSS)處理及過度刺激(OHSS)的卵巢指數(shù)均顯著高于其他3組 (P<0.05)。但各組及處理組間腎臟指數(shù)無顯著差異，見表2，圖2。

圖2 各組及處理組間臟器指數(shù)比較Fig.2 Comparation of the ovary and kidney index

表2 各組大鼠的卵巢、腎臟指數(shù)Table 2 Comparation of the ovary and kidney index

2.3 血液中孕激素、雌激素及VEGF濃度的比較

結(jié)果顯示，除4周齡Wistar 過度刺激(OHSS)處理組大鼠的血清VEGF水平和3周齡SD過度刺激(OHSS)處理組大鼠的血清雌激素水平高于對(duì)照組(Control)，差異顯著(P<0.05)；及3周齡SD過度刺激(OHSS)處理組大鼠的血清VEGF水平高于對(duì)照組(Control)，差異極顯著(P<0.01)外，其余各組內(nèi)不同處理間大鼠血清的雌激素、孕激素和VEGF水平均無顯著差異(P>0.05)，見表3、圖3。

表3 不同組大鼠血清中孕激素、雌激素及VEGF含量Table 3 Comparison of serum levels of progesterone，estrogen and VEGF in different groups

圖3 各組及處理組間血清孕激素、雌激素和VEGF水平的比較Fig.3 Comparison of serum levels of progesterone estrogen and VEGF in each group and treatment group

2.4 3周齡SD大鼠血管通透性改變

注射hCG后，3周齡SD大鼠中OHSS處理組的腹腔液中伊文思藍(lán)濃度顯著高于Mild OHSS組和Control組(P<0.05)，同時(shí)卵巢中的伊文思藍(lán)濃度也顯著高于其他兩組(P<0.05)，見圖4。

圖4 3周齡SD大鼠腹腔液和卵巢中伊文思藍(lán)濃度Fig.4 Evans blue concentration of peritoneal fluid and ovary in 3-week-old SD rats

3 討論

OHSS 是在超數(shù)排卵過程中最常見的一種臨床并發(fā)癥，嚴(yán)重時(shí)可危及生命。OHSS 發(fā)生的病理生理機(jī)制尚未完全闡明,一般認(rèn)為本病發(fā)生的主要誘因是由hCG刺激卵巢分泌并釋放血管活性物質(zhì)而導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加[9]。本實(shí)驗(yàn)參照了國(guó)內(nèi)、外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的造模經(jīng)驗(yàn),應(yīng)用不同劑量的hCG對(duì)不同周齡和不同品系的大鼠進(jìn)行刺激后發(fā)現(xiàn)所有不同周齡的大鼠用于造模的效果不盡相同。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，處于青春前期的3周齡SD大鼠更適用于進(jìn)行OHSS大鼠模型的建立，3周齡SD大鼠在PMSG聯(lián)合hCG作用下出現(xiàn)了明顯的卵巢增大，血管通透性增加，血清VEGF水平上升等OHSS典型改變。造模過程中大量使用的hCG可以刺激顆粒細(xì)胞分泌VEGF，大量分泌的VEGF則可以使血管通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致患有OHSS的個(gè)體出現(xiàn)腹水、血容量減低等癥狀。VEGF在OHSS的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[10-12]。因此血清VEGF可以作為一種檢測(cè)OHSS大鼠模型構(gòu)建是否成功的標(biāo)志性分子。與其他各組相比較，3周齡SD大鼠OHSS處理組的動(dòng)物血清VEGF水平顯著高于Mild OHSS組和Control組，3組間差異顯著(P<0.05)；而其他年齡或品系的大鼠組間VEGF水平則差異不顯著(P>0.05)。由此可見，3周齡SD大鼠更為適合用于OHSS模型的構(gòu)建。

與人類的OHSS表現(xiàn)進(jìn)行比較，通過注射一定劑量的的hCG而構(gòu)建的大鼠OHSS模型同樣會(huì)出現(xiàn)卵巢體質(zhì)量明顯增加，血管通透性增加，血清VEGF含量明顯增加等癥狀。但是由于大鼠OHSS模型在某些生化指標(biāo)和生理指標(biāo)方面仍舊未進(jìn)行詳細(xì)的量化指標(biāo)評(píng)價(jià)，因此本文中利用3周齡SD大鼠構(gòu)建OHSS模型雖取得了初步成功，但仍有待進(jìn)一步探討。