辛聞婷 楊媛媛 王馨宇 吳 東 李靈恩

(江蘇集萃藥康生物科技有限公司，南京 210061)

支原體(Mycoplasma)屬于柔膜體綱(Mollicutes)，支原體目(Mycoplasmatales)，支原體科(Mycoplasmataceae)，是能夠在無(wú)生命培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的最小微生物[1]。迄今為止，很多研究表明支原體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞有不同程度的污染[2-6]，給科研、教學(xué)、生產(chǎn)領(lǐng)域相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了很大的影響。

目前針對(duì)支原體的檢測(cè)方法有多種[7-8]，主要有病原分離鑒定法、血清學(xué)檢測(cè)方法(間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫組化方法、間接血凝試驗(yàn)等)和分子生物學(xué)檢測(cè)方法(PCR、熒光定量PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等)。其中，病原分離鑒定方法所需周期較長(zhǎng)(2～3周)、技術(shù)要求高；而免疫學(xué)方法容易和其它病原發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性和敏感性較差；因此分子生物學(xué)方法是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)支原體的首選方法。

本研究建立了支原體熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有快速、特異、靈敏、可大批量檢測(cè)的特點(diǎn)，并可根據(jù)測(cè)序結(jié)果判斷支原體類型，為實(shí)驗(yàn)室多種常見(jiàn)支原體的快速診斷提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和樣品

肺支原體(Mycoplasmapulmonis)與豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)為實(shí)驗(yàn)室分離保存。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersiniaenterocolitica)CMCC(B)52204、假結(jié)核耶爾森菌(Yersiniapseudotuberculosis)CMCC 53504、沙門(mén)氏菌(Salmonella)ATCC 14028、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)CMCC (B)46117、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC 27853、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 6538購(gòu)自環(huán)凱微生物科技有限公司，嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurellapneumotropica)ATCC 35149、鼠棒狀桿菌(Corynebacteriumkutscheri)ATCC 15677購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

不同來(lái)源的60份小鼠肺臟、60份細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)冷鏈運(yùn)輸至本單位后凍存于-20 ℃冰箱中。

1.2 主要試劑與儀器

AceQ U+Probe Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；蛋白酶K購(gòu)自上海鼓臣生物技術(shù)有限公司；EDTA與Tris-HCl購(gòu)自BIOSHARP公司。

Roche LightCycler 96購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；柏恒GE9612T智能梯度PCR儀器購(gòu)自杭州柏恒科技有限公司；天能EPS300電泳儀及電泳槽購(gòu)自上海天能科技有限公司；Quawell Q5000 超微量紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)QUAWELL科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

通過(guò)比對(duì)Genbank上多種大、小鼠易感支原體的16 s rRNA基因中較保守的區(qū)域，用Primer Express 3.0設(shè)計(jì)引物和探針序列，再使用Primer 5與Oligo 7軟件排除引物二聚體及錯(cuò)配后，最終確定引物(Myco FP、Myco RP)與探針(Myco P)的序列，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小為168 bp。引物和探針的序列見(jiàn)表1，由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

將目的片段的序列交由北京擎科新業(yè)生物科技有限公司合成含目的片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pUC57-myco。使用載體pUC57的通用測(cè)序引物M13 F、M13 R對(duì)得到的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，送北京擎科新業(yè)生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，根據(jù)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配置10 μL反應(yīng)體系：2× AceQ U+mix 5 μL，Myco FP 1 μL，Myco RP 1 μL，Myco P 1 μL，模板 1 μL，超純水補(bǔ)至10 μL。采用上述的反應(yīng)體系，將引物和探針的濃度分別配制成250、350、450、550 nmol/L，每個(gè)引物和探針濃度的組合做兩個(gè)重復(fù)，利用矩陣法對(duì)引物濃度和探針濃度進(jìn)行優(yōu)化。

用確定的引物、探針濃度及反應(yīng)體系，將退火溫度設(shè)置為58～65 ℃之間的8個(gè)隨機(jī)溫度梯度，每個(gè)溫度梯度做兩個(gè)重復(fù)，以優(yōu)化退火溫度。

表1 引物和探針序列Table 1 The sequence of primers and probe

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度，根據(jù)公式：待測(cè)質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=(6.02×1023×樣品濃度(ng/μL)×10-9)/(模板長(zhǎng)度×660)，計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝濃度。以10倍倍比稀釋至5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性模板，超純水為陰性對(duì)照，用已優(yōu)化好的程序進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 熒光定量PCR敏感性檢測(cè)

以5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL 6個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽(yáng)性模板，超純水為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行熒光定量PCR和普通PCR檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的靈敏性。

1.8 熒光定量PCR特異性檢測(cè)

用支原體熒光定量PCR方法對(duì)肺支原體、豬鼻支原體、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌進(jìn)行檢測(cè)。若產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

1.9 熒光定量PCR重復(fù)性檢測(cè)

以5×105、5×104、5×103、5×102copies/μL 4個(gè)濃度梯度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。組內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)為每個(gè)濃度梯度的模板設(shè)置4個(gè)重復(fù)；組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)為每個(gè)濃度梯度的模板獨(dú)立進(jìn)行4次。將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以評(píng)價(jià)本支原體熒光定量PCR的重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測(cè)

1.10.1樣品處理

肺臟樣品處理：剪取針尖大小的小鼠肺臟組織，放入滅菌后的1.5 mL Eppendorf管，加入500 μL含有蛋白酶K的消化液，在56 ℃培養(yǎng)箱中消化過(guò)夜。次日早晨將消化液12 000 r/min離心10 min后，取300 μL上清加入300 μL異丙醇，上下顛倒幾次后12 000 r/min離心10 min，棄去管內(nèi)液體充分晾干后，加100 μL超純水后即得樣品DNA。

細(xì)胞樣品處理：吸取細(xì)胞及培養(yǎng)液1 mL至Eppendorf管內(nèi)，12 000 r/min 5 min離心以收集底部細(xì)胞。棄上清后加入200 μL超純水吹打細(xì)胞，用恒溫混勻儀37 ℃孵育1 h后95 ℃ 300 r/min振搖使細(xì)胞裂解，即得基因組DNA。

1.10.2臨床樣品檢測(cè)：使用本研究建立的支原體熒光定量PCR方法和普通PCR方法對(duì)120個(gè)臨床樣品DNA進(jìn)行檢測(cè)，并比較兩種方法的檢出率。若產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的鑒定

對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示，目的片段與支原體屬中多種支原體的基因同源性達(dá)98%，表明標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過(guò)矩陣法優(yōu)化引物與探針的最佳濃度組合發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上、下游引物均為450 nmol/L，探針為250 nmol/L時(shí)，擴(kuò)增效率最佳。同時(shí)優(yōu)化退火溫度，確定熒光定量PCR反應(yīng)程序如下(其中包含降落PCR程序以增強(qiáng)特異性)：95 ℃ 2 min；前10個(gè)循環(huán)降落PCR：95 ℃ 10 s，65～60 ℃ 30 s(每循環(huán)下降0.5度)，72 ℃ 30 s；后30個(gè)循環(huán)普通PCR：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；最后37 ℃孵育30 s。

2.3 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度為158.97 ng/μL，根據(jù)1.6中公式計(jì)算可得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝濃度為5×1010copies/μL。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋至5×106、5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100copies/μL。用已優(yōu)化好的體系及程序進(jìn)行熒光定量PCR，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=-3.3679x+38.24，擴(kuò)增效率E=98.11%，相關(guān)系數(shù)R2=0.9972，表明該熒光定量PCR方法在5×100～5×106copies/μL之間能進(jìn)行高效擴(kuò)增且有很好的線性關(guān)系。

圖1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of the real-time PCR

2.4 熒光定量PCR的靈敏性

用熒光定量PCR方法和普通PCR方法對(duì)不同濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法能夠檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為5 copies/μL(圖2)，PCR方法能夠檢出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低濃度為5×102copies/μL(圖3)，表明本研究建立的支原體熒光定量PCR的檢測(cè)靈敏性是常規(guī)PCR方法的100倍。

圖2 熒光定量PCR靈敏性檢測(cè)注：6～1：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL；0：陰性對(duì)照Fig.2 Sensitivity test of the real-time PCRNote:6～1:The concentration of standard plasmid was 5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL,respectively;0:negative

圖3 普通PCR靈敏性檢測(cè)注：M：DL 2000 DNA Marker；1～6：質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL；7：陰性對(duì)照Fig.3 Sensitivity test of the conventional PCRNote:M:DL 2000 DNA Marker;1～6:The concentration of standard plasmid was 5×105、5×104、5×103、5×102、5×101、5×100 copies/μL,respectively;7:negative control

2.5 熒光定量PCR的特異性

用該熒光定量PCR方法對(duì)多種常見(jiàn)病原進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，肺支原體與豬鼻支原體有擴(kuò)增曲線，且測(cè)序結(jié)果均為支原體。而其他病原菌：小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線。

2.6 熒光定量PCR的重復(fù)性

選擇4個(gè)濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)本研究所建立的熒光定量PCR方法的重復(fù)性。結(jié)果如表2所示，組內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)低于1%，組間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)低于2%，表明該熒光定量PCR方法的重復(fù)性好，穩(wěn)定性高。

2.7 臨床樣品的檢測(cè)

用兩種方法分別對(duì)60份小鼠肺臟和60份細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果表明，支原體熒光定量PCR方法檢測(cè)小鼠支原體陽(yáng)性率為3.33%(2/60)，普通PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性率為1.67%(1/60)，測(cè)序均為肺支原體；支原體熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞樣品支原體陽(yáng)性率為5%(3/60)，與普通PCR方法檢測(cè)結(jié)果一致，測(cè)序結(jié)果分別為豬鼻支原體(M.hyorhinis)、發(fā)酵支原體(M.fermentans)、精氨酸支原體(M.arginina)。本次臨床樣品檢測(cè)結(jié)果也證明該熒光定量PCR方法的檢測(cè)靈敏性高于普通PCR方法。

圖4 熒光定量PCR特異性檢測(cè)注：1：肺支原體與豬鼻支原體；2：其他參與檢測(cè)的病原菌與陰性對(duì)照Fig.4 Specific test of the real-time PCRNote:1:Mycoplasma pulmonis and Mycoplasma hyorhinis;2:the other pathogenic strains participated in this test and negative control

表2 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Reproducibility test results of the real-time PCR

3 討論

大、小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，有資料表明實(shí)驗(yàn)用大、小鼠廣泛存在支原體感染[2-3]，常見(jiàn)的有肺支原體(M.pulmonis)、關(guān)節(jié)炎支原體(M.arhrititis)、溶神經(jīng)支原體(M.neurolyticum)等。其中，肺支原體是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物危害最大的一種支原體。肺支原體在大、小鼠中多呈隱性感染，導(dǎo)致動(dòng)物的繁殖能力降低；在受到應(yīng)激或免疫系統(tǒng)受到抑制時(shí)發(fā)病，并表現(xiàn)為咳嗽、肺炎等癥狀[9]。盡管支原體感染后多無(wú)明顯的臨床癥狀，但是病原的存在會(huì)對(duì)免疫學(xué)、老年病學(xué)、營(yíng)養(yǎng)學(xué)、行為學(xué)等實(shí)驗(yàn)造成一定干擾[10]。

目前國(guó)內(nèi)外常用的支原體檢測(cè)方法為病原培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法，每種方法各有利弊[7-8,11-12]。其中，分子生物學(xué)方法以其快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)吸引了越來(lái)越多的關(guān)注。常用的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要是常規(guī)PCR和熒光定量PCR，但熒光定量PCR的靈敏性遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR，且具有快速和高通量的優(yōu)勢(shì)，適合對(duì)大批量樣品進(jìn)行快速定量檢測(cè)。武昱孜等[13]用常規(guī)PCR、套式PCR以及熒光定量PCR方法檢測(cè)同一批樣品，結(jié)果顯示檢出率分別為18.0 %、53.9 %和55.1 %。何曼莉等[14]研究顯示，實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有快速、準(zhǔn)確和易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，能夠代替顏色變化單位(color change unit,CCU)法和濁度法對(duì)綿羊支原體進(jìn)行定量。

本研究針對(duì)多種大、小鼠易感支原體的16 s rRNA基因中較保守的區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，建立了支原體熒光定量PCR檢測(cè)方法。該熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.9972，擴(kuò)增效率E=98.11%，具有良好的線性關(guān)系，且當(dāng)模板濃度在5×100～ 5×106copies/μL之間時(shí)能進(jìn)行高效擴(kuò)增。該方法特異性強(qiáng)，與小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、假結(jié)核耶爾森菌、沙門(mén)氏菌、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球、綠膿桿菌、鼠棒狀桿菌無(wú)交叉反應(yīng)；靈敏性高，最低檢測(cè)限為5copies/μL，靈敏性較常規(guī)PCR方法高100倍，同時(shí)還能通過(guò)測(cè)序鑒定支原體亞型；穩(wěn)定性好，組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均低于2%。用該方法進(jìn)行小鼠和細(xì)胞兩種樣品的臨床檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)了該方法可用于小鼠的臨床樣品檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果與已報(bào)道的支原體流行率相符[2]。

另外，值得關(guān)注的是，該方法也可用于細(xì)胞易感支原體的檢測(cè)。細(xì)胞對(duì)于各種生物制品、科研實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)是必不可少的實(shí)驗(yàn)材料之一。自從Robinson等在1956年從一株Hela細(xì)胞培養(yǎng)液中分離出支原體以來(lái)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)支原體污染細(xì)胞的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。目前已報(bào)道的能夠污染細(xì)胞的支原體有二十多種，常見(jiàn)的有發(fā)酵支原體(M.fermentans)、豬鼻支原體(M.hyorhinis)、精氨酸支原體(M.arginina)、人型支原體(M.hominis)等[15-17]。支原體感染后的細(xì)胞往往生長(zhǎng)狀態(tài)不佳[18]，且細(xì)胞的DNA、RNA和蛋白的表達(dá)可能發(fā)生變化[19]，降低實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究建立的支原體熒光定量PCR檢測(cè)方法能夠同時(shí)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞易感支原體，提升了其應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究成功建立了實(shí)驗(yàn)室多種常見(jiàn)支原體的熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有高特異性、高靈敏性、高穩(wěn)定性、高通量及快速準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，為實(shí)動(dòng)物常見(jiàn)支原體的快速檢測(cè)提供了方法。