胡青峰，趙宏磊，白濤，薛金熔，劉永民，孫立忠

血管新生是傷口愈合和恢復(fù)血液流通的關(guān)鍵，常會引起血管增生、腫瘤等疾病的發(fā)生[1]。人纖溶酶原Kringle 5（K5）是眾多血管抑制分子中活性較強且比較穩(wěn)定的血管增生抑制因子，其可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡的發(fā)生，而對于其作用機制尚不清楚[2-4]。生存素（Survivin）是一種凋亡抑制蛋白，影響多種細胞凋亡過程，在腫瘤、瘢痕增生等多種疾病發(fā)生過程中具有關(guān)鍵作用[5,6]。研究表明，生存素與血管瘤的消退、增生等有關(guān)，具有促進血管瘤增生的作用[7]。本文以血管內(nèi)皮細胞為分析對象，探討生存素在K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用，為明確K5抑制血管增生機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料健康產(chǎn)婦分娩新生兒臍帶由廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院提供；pEGFP-N3/生存素由廣東醫(yī)谷醫(yī)學(xué)實驗室構(gòu)建保存；重組蛋白K5由廣東醫(yī)谷醫(yī)學(xué)實驗室保存；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自美國Thermo公司；線粒體蛋白提取試劑盒購自南京Enogene；qRT-PCR購自北京百奧萊博；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen；生存素、引物由南京金斯瑞合成；細胞色素C（Cyt C）抗體、生存素抗體購自美國Abcam；JC-1線粒體膜電位（△Ψm）檢測試劑盒購自碧云天（有很多公司，請標明清楚）；Caspase-3、9活性測定試劑盒購自北京普利萊公司；三磷酸腺苷（ATP）含量測定試劑盒購自南京建成；活性氧（ROS）含量測定試劑盒購自上海翊圣。

1.2 血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)及分組血管內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)方法參照文獻[8]，取新生兒臍帶，在臍靜脈內(nèi)添加0.25%的胰蛋白酶使內(nèi)皮細胞脫落。用胎牛血清終止消化以后。用10%胎牛血清的M199懸浮細胞，種植到培養(yǎng)瓶內(nèi)。12 h后把未貼壁的細胞洗滌掉。細胞密度約為90%，用0.25%胰蛋白酶傳代后，取第4代細胞用于實驗研究。分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)間接免疫熒光法顯示Von Willebrand因子呈陽性，鑒定為血管內(nèi)皮細胞。

1.3 細胞分組血管內(nèi)皮細胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N3/生存素和對照載體pEGFP-N3后，在實驗0 h時用含有640 nmol/L的K5的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)分別記為K5+生存素和K5+NC（對照組）。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。同時以不做任何處理的血管內(nèi)皮細胞記為Control（空白組），以不做轉(zhuǎn)染的細胞在0 h時用含有640 nmol/L的K5的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)記為K5。同時Control、K5、K5+NC、K5+生存素細胞在實驗0 h時分別添加20 ng/ml的bFGF誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增生，各組細胞在培養(yǎng)24 h后，進行后續(xù)實驗指標檢測。實驗過程中的血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中均不添加胎牛血清。

1.4 qRT-PCR檢測K5作用的血管內(nèi)皮細胞中生存素表達Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，提取細胞RNA，用紫外分光光度計測定各組細胞中RNA的濃度。用qRT-PCR檢測生存素mRNA的水平，以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct法計算。

1.5 Western blot檢測K5作用后的血管內(nèi)皮細胞生存素的表達Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，提取細胞總蛋白。用90 V電壓進行電泳。把蛋白在200 mA恒流轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白于室溫封閉。與1∶600稀釋的生存素抗體在4 ℃中孵育，再與1∶2000稀釋的二抗在室溫孵育。ECL發(fā)光以后，用Quantity One對各組條帶的灰度值進行分析，用生存素的灰度值與GAPDH的灰度值表示生存素蛋白水平。

1.6 細胞凋亡測定細胞凋亡測定用流式細胞儀檢測。Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，加入約500 μl的Binding buffer，混合后，再添加PI和Annexin V-FITC 5 μl，避光反應(yīng)約15 min，每隔3 min混合1次，在1 h內(nèi)檢測各組細胞凋亡。

1.7 線粒體膜電位測定Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，用JC-1法測定細胞線粒體膜電位，步驟參照試劑盒說明書。結(jié)果以實驗細胞的紅色熒光/綠色熒光同Control細胞的紅色熒光/綠色熒光的比值表示△Ψm。

1.8 ATP含量測定Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，用比色法測定細胞勻漿液中ATP含量，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.9 Caspase-3、Caspase-9活性檢測Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，用比色法測定細胞中Caspase-3、Caspase-9活性，具體步驟參照試劑盒說明書進行。結(jié)果以實驗細胞A值與Control細胞A值的比值表示Caspase-3、Caspase-9活性。

1.10 胞質(zhì)和線粒體中Cyt C表達檢測Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，提取胞質(zhì)蛋白和線粒體蛋白，用Western blot法測定胞質(zhì)和線粒體中Cyt C的表達，步驟同上。線粒體中Cyt C蛋白水平以Cyt C灰度值÷porin灰度值表示，胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平以Cyt C灰度值÷GAPDH灰度值表示。

1.11 ROS含量檢測Control、K5、K5+NC、K5+生存素按照上述方法處理以后，收集各組細胞，用PBS洗滌2次以后，按照試劑盒說明書檢測熒光強度，用實驗細胞熒光強度與Control細胞熒光強度表示ROS水平。

1.12 統(tǒng)計學(xué)分析所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料用（±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后的細胞經(jīng)K5誘導(dǎo)后細胞中生存素表達Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞中生存素mRNA水平依次為：1.00、0.37±0.03、0.36±0.04、0.74±0.02，蛋白水平依次為：0.87±0.06、0.21±0.04、0.21±0.06、0.44±0.04。Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞中生存素mRNA和蛋白表達比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F1=398.448，P1=0.000，F(xiàn)2=111.721，P2=0.000），K5細胞中生存素mRNA和蛋白表達均低于Control組（P＜0.05）。K5+生存素細胞中生存素mRNA和蛋白表達均高于K5（P＜0.05）。K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞中生存素的表達下調(diào)，而轉(zhuǎn)染生存素真核表達載體以后可以有效促進細胞中生存素的表達（圖1）。

圖1 Western blot測定轉(zhuǎn)染以后的細胞經(jīng)K5誘導(dǎo)后Survivin蛋白表達

2.2 過表達生存素減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞凋亡率依次為：（3.69±2.54）%、（36.58±3.97）%、（37.46±3.65）%、（22.64±1.47）%，4組細胞凋亡率比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=57.843，P=0.000）。K5細胞凋亡率高于Control（P＜0.05）。K5+生存素細胞凋亡率低于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡，過表達生存素降低細胞凋亡水平（圖2）。

圖2 流式細胞術(shù)測定生存素對K5誘導(dǎo)的細胞凋亡影響

2.3 生存素減弱K5對血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位和ATP合成的影響Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞線粒體膜電位△Ψm依次為：1.00、0.44±0.05、0.43±0.05、0.85±0.10，ATP合成水平依次為：1.00、0.65±0.10、0.68±0.06、0.91±0.05。4組細胞△Ψm和ATP水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F1=67.040，P1=0.000，F(xiàn)2=22.826，P2=0.000），K5細胞△Ψm和ATP水平均低于Control（P＜0.05）。K5+NC細胞△Ψm和ATP水平與K5比較沒有變化（P＞0.05）。K5+生存素細胞△Ψm和ATP水平均高于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞△Ψm升高，減少ATP合成，而生存素可以減弱K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞△Ψm下降和ATP合成減少。

2.4 生存素減弱K 5 對血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3、Caspase-9活化影響4組細胞Caspase-3、Caspase-9活性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F1=38.321，P1=0.000，F(xiàn)2=64.518，P2=0.000），K5細胞Caspase-3、9活性均高于Control（P＜0.05）。K5+生存素細胞Caspase-3、Caspase-9活性均低于K5（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3、Caspase-9的活化，而生存素可降低K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3、Caspase-9活化水平（圖3）。

圖3 生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3、Caspase-9活化影響：A.生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中Caspase-3活化水平影響；B.生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中Caspase-9活化水平影響；與Control相比，aP＜0.05；與K5相比，bP＞0.05；與K5相比，cP＜0.05

2.5 生存素降低K5作用后的血管內(nèi)皮細胞線粒體釋放Cyt CControl、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞線粒體中Cyt C蛋白水平依次為：1.13±0.08、0.35±0.04、0.35±0.05、0.57±0.05，胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平依次為：0.15±0.05、0.81±0.09、0.79±0.13、0.31±0.03。4組細胞線粒體及胞質(zhì)中的Cyt C蛋白水平整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F1=125.169，P1=0.000，F(xiàn)2=47.592，P2=0.000），K5細胞線粒體中Cyt C蛋白水平低于Control，而胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平明顯高于Control，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。K5+生存素細胞線粒體中Cyt C蛋白水平明顯高于K5，而胞質(zhì)中Cyt C蛋白水平低于K5，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果顯示，K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞線粒體釋放Cyt C，而生存素可以減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞釋放Cyt C（圖4）。

圖4 生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)和線粒體中Cyt C蛋白影響：A.Western blot測定生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞線粒體中Cyt C蛋白表達；B.Western blot測定生存素對K5作用后的血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)中Cyt C蛋白表達

2.6 生存素降低K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中ROS水平Control、K5、K5+NC、K5+生存素組細胞中ROS水平依次為：1.00、2.78±0.17、2.77±0.10、1.84±0.12。4組細胞的ROS水平整體比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=164.268，P=0.000），K5細胞中ROS水平高于Control（P＜0.05）。K5+NC細胞中ROS水平與K5比較無明顯變化（P＞0.05）。K5+生存素細胞中ROS水平低于K5（P＜0.05）。K5誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞中ROS升高，過表達生存素降低細胞中ROS水平。

3 討論

本組結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細胞凋亡率增加，K5通過線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡，同時K5作用后細胞中生存素水平降低，生存素過表達可以通過線粒體途徑減少K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡。

K5是纖溶酶原的抗血管增生中活性最強的裂解片段[9]。研究顯示，K5可以抑制視網(wǎng)膜血管增生大鼠新生血管的形成[10]。文獻報道重組K5蛋白可以在體外誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞的凋亡，影響Caspase級聯(lián)反應(yīng)的激活[11]。

生存素由142個氨基酸組成，能夠調(diào)控細胞凋亡和血管形成，在bFGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞中表達升高，而bFGF是公認的促進血管形成的分子，腫瘤壞死因子等炎癥因子不能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞中生存素表達升高[12-14]。研究顯示，生存素表達下調(diào)后可抑制移植靜脈小鼠內(nèi)膜的增生[15]。正常情況下，生存素在非增殖的血管內(nèi)皮細胞中表達水平極低，而在肉芽所產(chǎn)生的新生血管中其表達水平異常升高[16]。本實驗結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中生存素水平降低，提示K5可能通過降低生存素的表達誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡。

細胞凋亡的產(chǎn)生與線粒體膜電位降低有關(guān)，而線粒體膜電位下降與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放密切相關(guān)，當(dāng)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放后，位于線粒體內(nèi)的Cyt C進入到細胞質(zhì)內(nèi)，激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[17]。ROS主要是由線粒體產(chǎn)生，而ROS的作用靶點也主要是線粒體，ROS可以誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，引起線粒體腫大，導(dǎo)致氧化磷酸化及呼吸鏈異常，引起ATP合成減少，觸發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。本實驗的結(jié)果顯示，K5作用后的血管內(nèi)皮細胞中ATP的合成減少，線粒體膜電位下降，細胞中ROS水平升高，線粒體釋放到胞質(zhì)中的Cyt C也增加，說明K5可以通過線粒體途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞凋亡，而生存素可升高K5作用后的血管內(nèi)皮細胞線粒體膜電位，促進ATP的合成，減少Caspase-3和Caspase-9的活化，減少線粒體釋放到胞質(zhì)中的Cyt C，提示生存素在K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡中具有重要作用，作用機制與線粒體途徑有關(guān)。

綜上，生存素影響K5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡，在線粒體膜電位調(diào)控、ATP合成、ROS產(chǎn)生中具有重要作用，參與血管增生，這對于以后研究K5抑制血管增生的作用機制具有重要意義。本實驗尚未探討生存素和K5在體內(nèi)血管增生中的作用，在以后實驗中會對這一部分進行深入分析。