謝紅英，羅曉麗，羅浩

病毒性心肌炎是一種臨床常見的心臟疾病，其發(fā)病原因與前期病毒感染密切相關(guān)。關(guān)于病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制，假說眾多，而病毒感染后引起的炎癥反應(yīng)在其中具有重要作用[1]。機(jī)體因外源性病原體入侵，引起心肌局限性或彌漫性炎癥病變，導(dǎo)致炎性細(xì)胞向該部位聚集，同時過度激活自身免疫反應(yīng)，損傷心肌細(xì)胞[2]。有研究顯示，病毒性心肌炎患者外周血炎性因子水平明顯升高，主要表現(xiàn)為腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素-1β等[3]。近年來，有研究表明，病毒性心肌炎是一類炎癥性疾病，與自身免疫功能紊亂密切相關(guān)，不同類型的CD4+T細(xì)胞亞群在病毒性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展過程扮演了重要作用[4]。Th22細(xì)胞是一類新的CD4+T細(xì)胞亞群，其特異性分泌IL-22，激活相應(yīng)信號通路如JAK-STAT信號通路，參與了多種疾病如自身免疫性疾病及惡性腫瘤的發(fā)病過程[5]。Th22細(xì)胞是否參與了病毒性心肌炎的發(fā)生、發(fā)展，目前相關(guān)研究尚未闡明。因此，本研究擬通過分析病毒性心肌炎患者外周IL-22水平，旨在探討Th22細(xì)胞在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用，為該疾病的臨周血Th22細(xì)胞床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2013年5月～2018年5月于陸軍軍醫(yī)大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）大坪醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的病毒性心肌炎患者180例作為研究對象，其中男性105例，女性75例，年齡18歲～70歲，平均年齡（35.4±15.8）歲，所有患者均符合病毒性心肌炎診斷與治療指南[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有冠心病、感染性心內(nèi)膜炎及心臟瓣膜病的患者；存在自身免疫性疾病和免疫缺陷的患者；惡性腫瘤的患者。根據(jù)入選患者心功能指標(biāo)，評判病情嚴(yán)重程度，射血分?jǐn)?shù)（LVEF）≥50%為輕度（70例），LVEF在40%～49%為中度（56例），LVEF＜40%為重度（54例）。同時選取60例健康體檢人群為對照組。健康對照組和病毒性心肌炎組及病毒性心肌炎各嚴(yán)重程度組間在性別、年齡等方面無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。該研究獲得了我院倫理委員會的批準(zhǔn)并征得了患者書面知情同意。

1.2 主要試劑RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（美國Gibco公司）、胎牛血清（美國HyClone公司）；佛波酯及離子霉素（美國Sigma公司）；莫能霉素（中國瑞利康公司）；淋巴細(xì)胞分離液、細(xì)胞固定液及細(xì)胞破膜劑（美國GE公司）；單克隆抗體（CD4和IL-22）（美國Invitrogen公司）；IL-22 和IL-17酶聯(lián)免疫試劑盒（中國博士德公司）。

1.3 方法

1.3.1 外周血Th22細(xì)胞水平檢測首先制備樣本，抽取病毒性心肌炎組患者及健康對照組空腹靜脈血5 ml，經(jīng)肝素充分抗凝后，提取單核細(xì)胞。在無菌操作臺中，將上述單核細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，培養(yǎng)板中含RPMI-1640培養(yǎng)基，同時加入抗菌素（佛波酯，劑量30 μl，濃度1 μg/ml），培養(yǎng)箱中孵育5 h。收集上述細(xì)胞，加入抗人CD4單克隆抗體10 μl，震蕩混勻，室溫避光孵育30 min后，加入2 ml破膜液，靜置離心后（1000 g，5 min，室溫），吸去上清，加入IL-22單克隆抗體10 μl，震蕩混勻后，待上機(jī)檢測。

1.3.2 外周血炎性細(xì)胞因子（IL-22、IL-17）的檢測 取病毒性心肌炎組患者及健康對照組清晨空腹靜脈血5 ml，離心后收集上清，采用ELISA法測定不同病毒性心肌炎組間外周血IL-22、IL-17水平及健康對照組IL-22水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析采用專業(yè)統(tǒng)計學(xué)軟件（SPSS 19.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與處理。計量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間（健康對照組與病毒性心肌炎組）比較采用t檢驗，而不同嚴(yán)重程度的病毒性心肌炎組間比較采用單因素方差分析。采用Spearman相關(guān)法分析外周血Th22細(xì)胞與IL-22、IL-17的相關(guān)性。運用Graphpad軟件做ROC曲線分析，計算外周血Th22細(xì)胞的ROC曲線下面積（AUC）、最佳工作點（OOP）、敏感性及特異性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒性心肌炎組與健康對照組外周血Th22細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-22水平與健康對照組比較，病毒性心肌炎組患者外周血Th22細(xì)胞及細(xì)胞因子IL-22水平升高（P＜0.05）（表1、圖1）。

表1 病毒性心肌炎組與健康對照組外周血Th22細(xì)胞及IL-22水平比較

圖1 兩組外周血Th22細(xì)胞水平比較

2.2 不同嚴(yán)重程度病毒性心肌炎組間Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較不同嚴(yán)重程度病毒性心肌炎組間外周血Th22細(xì)胞、IL-22及IL-17水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，重度病毒性心肌炎組上述指標(biāo)水平最高，中度組次之，輕度組最低（表2）。

2.3 病毒性心肌炎組外周血Th22細(xì)胞與相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性分析病毒性心肌炎組患者外周血Th22細(xì)胞水平與IL-22、IL17呈顯著正相關(guān)（r=0.874，P＜0.0001；r=0.865，P=0.0001）（圖2）。

2.4 外周血Th22細(xì)胞水平對病毒性心肌炎患者病情嚴(yán)重程度預(yù)測的ROC曲線分析通過以外周血Th22細(xì)胞水平來評估病毒性心肌炎患者病情嚴(yán)重程度，繪制ROC曲線。其結(jié)果顯示，外周血Th22細(xì)胞水平的曲線下面積（AUC）為0.846（95%CI 0.754～0.937），其最佳工作點分別為8.1 %，提示外周血Th22細(xì)胞水平＞8.1 %，此時預(yù)測病毒性心肌炎患者嚴(yán)重程度的精確率較高（敏感性為76.9%和特異性為81.0%）（圖3）。

3 討論

病毒性心肌炎是臨床常見的心血管疾病之一，多數(shù)患者預(yù)后良好，少數(shù)遷延不愈，持續(xù)炎癥，可使心臟擴(kuò)大，進(jìn)展為擴(kuò)張性心肌病。目前，多種方法用于病毒性心肌炎的診斷與病情嚴(yán)重程度的評估，如心肌活檢作為診斷病毒性心肌炎的金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有一定創(chuàng)傷，臨床運用受到局限[7]。心臟超聲可作為病毒性心肌炎的輔助診斷，對于評價心功能具有一定臨床價值，但特異性較差[8]。傳統(tǒng)的炎性指標(biāo)如C反應(yīng)蛋白、中性粒細(xì)胞比例等，對于病毒性心肌炎病情嚴(yán)重程度的評估，有一定的參考價值，但特異性偏低[9]。因此，探尋特異性指標(biāo)，準(zhǔn)確預(yù)測病毒性心肌炎患者病情嚴(yán)重程度，對于提高病毒性心肌炎患者臨床療效及預(yù)后，具有重要的臨床意義。

表2 不同嚴(yán)重程度病毒性心肌炎組間Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平的比較

圖2 病毒性心肌炎組患者外周血Th22細(xì)胞水平與IL-22、IL17的相關(guān)性

圖3 病毒性心肌炎組患者外周血Th22細(xì)胞對其病情嚴(yán)重程度的預(yù)測價值分析

有研究顯示，病毒性心肌炎是一類自身免疫功能異常引起的炎癥性疾病[10]。一方面，病毒可損傷心肌細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，同時心肌細(xì)胞釋放自身抗原[11]。機(jī)體通過固有免疫，激活Toll樣受體2，進(jìn)而促進(jìn)外周血單核細(xì)胞分泌相關(guān)細(xì)胞因子（IL-12、IL-1β、TNF-α），聚集于受損的心肌局部，在局部形成炎癥反應(yīng)，發(fā)揮免疫應(yīng)答作用[12]。除了固有免疫以外，有研究顯示，Th17細(xì)胞及其特異性分泌的IL-17在病毒性心肌炎的免疫損傷和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其中，病毒性心肌炎患者體內(nèi)Th17和IL-17水平明顯升高[13]。Th22細(xì)胞是一類與Th17細(xì)胞作用類似的CD4+淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌IL-22，發(fā)揮促進(jìn)炎癥的作用。外周血Th22細(xì)胞除了特異性分泌IL-22以外，還可分泌IL-17及TNF-α等，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤患者中明顯升高，且與病情的嚴(yán)重程度及預(yù)后相關(guān)[14-16]。外周血Th22細(xì)胞是否參與了病毒性心肌炎的發(fā)病，同時與病情嚴(yán)重程度如何，目前尚不清楚。本研究對病毒性心肌炎患者外周血Th22及IL-22水平進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，與健康對照組比較，病毒性心肌炎患者外周血Th22細(xì)胞及IL-22水平明顯升高，表明病毒性心肌炎的發(fā)生可能與Th22細(xì)胞活化有關(guān)。有研究顯示，病毒性心肌炎患者存在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞功能與分化失調(diào)，是造成免疫功能異?；罨?，引起病情加重的重要原因[17]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，病毒性心肌炎患者外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-22及IL-17與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，其曲線下面積較大，預(yù)測價值較高，表明其對病情嚴(yán)重程度有一定預(yù)測價值。Th22細(xì)胞是炎癥反應(yīng)放大的重要環(huán)節(jié)，有研究顯示，抑制Th22細(xì)胞分化，可顯著降低體內(nèi)炎性細(xì)胞因子水平，從而降低炎癥反應(yīng)。針對病毒性心肌炎患者，檢測外周血Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平，不僅可預(yù)測患者病情嚴(yán)重程度，同時還可為其治療提供新的靶點。

綜上所述，病毒性心肌炎患者外周血Th22細(xì)胞水平與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，對病毒性心肌炎病情評估及預(yù)后判斷具有重要的臨床意義。