李文玲， 雷燕芬， 王成輝， 嚴(yán)繼舟

(1. 上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所∥農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201306; 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心, 上海 201306)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)又名河蟹，是我國(guó)主要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類(lèi).河蟹因其獨(dú)特的口味且具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而深受消費(fèi)者的喜歡.河蟹富含豐富的脂類(lèi)物質(zhì)，其肝胰腺是脂類(lèi)的代謝中心，脂類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)32.79%[1].成永旭等[2]的研究表明：肝胰腺中儲(chǔ)存的脂類(lèi)主要是中性脂，磷脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)很少，僅占總脂的10%～20%，并且這些磷脂含有不同于植物磷脂的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)成分.脂類(lèi)是構(gòu)成生物有機(jī)體的主要成分之一，對(duì)機(jī)體具有重要的生物學(xué)作用和生理學(xué)調(diào)控功能[3-4].活性脂類(lèi)在細(xì)胞內(nèi)的含量較少卻具有重要而獨(dú)特的生物學(xué)功能，是近年來(lái)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn).過(guò)去的二十年里，越來(lái)越多的人意識(shí)到某些疾病與脂類(lèi)的缺乏有關(guān)[5].河蟹肝胰腺中脂肪酸的組成主要有: 棕櫚酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸.其中多不飽和脂肪酸因其獨(dú)特的生物活性,已經(jīng)進(jìn)入生物制藥和營(yíng)養(yǎng)保健領(lǐng)域.近來(lái)的研究表明，多不飽和脂肪酸還參與控制細(xì)胞的增殖和分化,是各種脂肪代謝酶和相關(guān)蛋白進(jìn)行基因表達(dá)的一種重要調(diào)節(jié)因子.

目前，關(guān)于河蟹肝胰腺脂類(lèi)功能的研究?jī)H限于脂肪酸類(lèi)，對(duì)于肝胰腺中其他脂類(lèi)物質(zhì)在細(xì)胞水平的研究鮮有報(bào)道.本研究前期的實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)了河蟹肝胰腺中的脂類(lèi)物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其中含有C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸，N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯，磷酰膽堿和棕櫚酰肉堿4種活性脂類(lèi).C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸是一種新型的具有生物活性的鞘脂類(lèi).磷酰膽堿由一個(gè)帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)和一個(gè)帶正電的膽堿小基團(tuán)組成，是血小板活化因子的一部分，是一種沒(méi)有甘油骨架的磷脂[6].C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和磷酰膽堿都屬于磷脂，主要參與細(xì)胞膜的組成.棕櫚酰肉堿是一種參與脂肪酸代謝的長(zhǎng)鏈?；鈮A, 可刺激caspase 3、7和8的活性,在細(xì)胞凋亡過(guò)程中棕櫚酰肉堿的水平會(huì)升高[7].N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯屬于內(nèi)脂類(lèi)化合物，該類(lèi)化合物大都具有潛在的生物活性.本研究初步探究河蟹肝胰腺中4種脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)斑馬魚(yú)胚胎成纖維細(xì)胞(PAC2)細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，以期為活性脂類(lèi)功能的營(yíng)養(yǎng)基因組學(xué)深入研究提供基礎(chǔ)和方法借鑒.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PAC2細(xì)胞引進(jìn)于美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院，C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸、N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯、磷酰膽堿購(gòu)于美國(guó)Cayman chemical公司，棕櫚酰肉堿購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，CCK-8試劑盒和LDH試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，二甲基亞砜(DMSO)、線粒體標(biāo)記試劑盒和溶酶體標(biāo)記試劑盒購(gòu)于上海生工生物有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱和超凈工作臺(tái)購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司，熒光倒置顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司，離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Eppendorf公司，酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)BioTek公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PAC2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的L15培養(yǎng)液中，置于32 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8].每48 h傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

A：C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸; B:N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯; C:磷酰膽堿； D:棕櫚酰肉堿

A： C-8 Ceramide-1-phosphate; B: N-dodecanoyl-L-Homoserine lactone; C: Oleyloxyethyl Phosphorylcholine; D: Palmitoyl-L-carnitine inhibited

圖1 脂類(lèi)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

Fig.1 Chemical structures of lipids

1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PAC2細(xì)胞消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL.貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h使細(xì)胞同步化.吸去孔中的上清液，用PBS緩沖液清洗1～2次.分別加入質(zhì)量濃度分別為1.25、5、20、80 μg/μL的4種脂類(lèi)100 μL，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組(相同質(zhì)量濃度脂類(lèi)溶解介質(zhì)的DMSO)和空白對(duì)照組(無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)基).將96孔培養(yǎng)板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和36 h，棄上清并用PBS緩沖液清洗2次.每孔加入10 μL CCK-8和90 μL無(wú)血清的L15培養(yǎng)基，32 ℃孵育過(guò)夜，用酶標(biāo)儀(microplate reader)在450 nm處測(cè)定各孔的光密度，每個(gè)組均有3個(gè)復(fù)孔[9].

1.2.3 乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)

LDH釋放檢測(cè)同CCK-8檢測(cè)一樣, 先用不同質(zhì)量濃度的4種脂類(lèi)處理PAC2細(xì)胞24和36 h，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和樣品最大酶活性對(duì)照組(未經(jīng)脂類(lèi)處理的用于后續(xù)裂解的細(xì)胞).到達(dá)預(yù)定檢測(cè)時(shí)間，將96孔培養(yǎng)板400 g離心5 min，分別取上清液120 μL，加入到新的96孔板對(duì)應(yīng)孔中進(jìn)行胞外LDH釋放檢測(cè)(細(xì)胞沉淀用于后續(xù)分析).加入60 μL LDH檢測(cè)工作液，混勻.室溫避光孵育2 h，用酶標(biāo)儀在490 nm測(cè)吸光度值，所有組別均有3個(gè)復(fù)孔.

上述細(xì)胞沉淀用于胞內(nèi)總LDH含量的檢測(cè).加入150 μL用PBS稀釋了10倍的LDH釋放試劑工作液，搖晃混勻，32 ℃孵育1 h.到達(dá)預(yù)定時(shí)間，將96孔培養(yǎng)板400 g離心5 min.取120 μL上清液加入到新的96孔培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)孔中，加入60 μL LDH檢測(cè)工作液混勻并避光孵育2 h，在490 nm測(cè)吸光度值.

1.2.4 線粒體和溶酶體完整性檢測(cè)

取5×104/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PAC2細(xì)胞100 μL接種到96孔板中，用4種脂類(lèi)藥物干預(yù)PAC2細(xì)胞24 h，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組.加入等體積的溶酶體(紅色)和線粒體(綠色)工作液，32 ℃孵育1 h.然后棄上清，用VL15培養(yǎng)基∶VPBS=1∶1的緩沖液洗滌3次.分別用TRITC和FITC濾光器的熒光顯微鏡(OLYMPUS TH4-200)觀察細(xì)胞并拍照.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 4種脂類(lèi)對(duì)PAC2細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力的影響

檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，通常采用的方法是藥物加入后測(cè)定細(xì)胞的存活與增殖情況[12].本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8分別檢測(cè)了不同質(zhì)量濃度的4種脂類(lèi)對(duì)PAC2細(xì)胞增殖和細(xì)胞活性的影響，結(jié)果分析用相對(duì)細(xì)胞數(shù)量(實(shí)驗(yàn)組光密度與對(duì)照組光密度的比值)表示.24 h的結(jié)果顯示(圖2A)，在質(zhì)量濃度1.25 μg/mL時(shí)，4種脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)PAC2細(xì)胞計(jì)數(shù)均未表現(xiàn)出明顯的改變.在質(zhì)量濃度5、20和80 μg/mL的磷酰膽堿顯著抑制PAC2細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為相對(duì)細(xì)胞數(shù)量比對(duì)照組明顯降低；C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和棕櫚酰肉堿在質(zhì)量濃度20和80 μg/mL時(shí)也表現(xiàn)為相對(duì)細(xì)胞數(shù)量的顯著降低，且呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性.而N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯在質(zhì)量濃度5和80 μg/mL時(shí)對(duì)PAC2細(xì)胞表現(xiàn)為極顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性.

培養(yǎng)36 h的觀察顯示(圖2B)，在1.25、5、20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸、磷酰膽堿和棕櫚酰肉堿對(duì)PAC2細(xì)胞均表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖，與24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合.但N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖的活性，與24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反.

A: 24 h CCK-8分析; B: 36 h CCK-8分析. 與對(duì)照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h CCK-8 assay; B: 36 h CCK-8 assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.2 4種脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損壞會(huì)導(dǎo)致胞漿內(nèi)的酶釋放到培養(yǎng)液中，其中包括酶活性較穩(wěn)定的乳酸脫氫酶.乳酸脫氫酶釋放檢測(cè)被認(rèn)為是細(xì)胞膜完整性檢測(cè)的重要指標(biāo)，根據(jù)胞漿中乳酸脫氫酶能通過(guò)受損細(xì)胞膜漏出的特點(diǎn)[12]，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜完整性的定量分析.結(jié)果分析用相對(duì)LDH含量(實(shí)驗(yàn)組光密度與對(duì)照組光密度的比值)表示.

使用不同質(zhì)量濃度的C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸處理PAC2細(xì)胞.細(xì)胞處理24 h的結(jié)果顯示(圖3A)：與對(duì)照組相比，培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量在1.25和5 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著降低，在20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高.36 h的結(jié)果顯示(圖3B)：培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量在5、20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高，并存在劑量依賴(lài).

使用不同質(zhì)量濃度的N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理PAC2細(xì)胞.細(xì)胞處理24 h的結(jié)果顯示：培養(yǎng)液中LDH的含量在1.25、5、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著高于對(duì)照組；但36 h的結(jié)果顯示：培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量在5和20 μg/mL質(zhì)量濃度下沒(méi)有明顯變化，在1.25和80 μg/mL質(zhì)量濃度下與24 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

使用不同質(zhì)量濃度的磷酰膽堿處理PAC2細(xì)胞.細(xì)胞處理24 h和36 h的結(jié)果基本一致：培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下沒(méi)有顯著變化，而5、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高，且存在劑量依賴(lài).

使用不同質(zhì)量濃度的棕櫚酰肉堿處理PAC2細(xì)胞.細(xì)胞處理24 h和36 h的結(jié)果基本一致：培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量在1.25、5和80 μg/mL質(zhì)量濃度下均顯著升高.但20 μg/mL質(zhì)量濃度下培養(yǎng)液中LDH的相對(duì)含量?jī)H在36 h表現(xiàn)為顯著升高，24 h未發(fā)生顯著變化.

A: 24 h LDH釋放分析; B: 36 h LDH釋放分析. 與對(duì)照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h the release of LDH assay; B: 36 h the release of LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

細(xì)胞內(nèi)總LDH的含量一方面可以反映細(xì)胞糖酵解代謝生成乳酸的能力，另一方面得以間接反應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的多少.結(jié)果分析用相對(duì)LDH含量表示.C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸和磷酰膽堿處理的PAC2細(xì)胞24 h(圖4A)和36 h(圖4B)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致：在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH含量沒(méi)有顯著變化；在5 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH相對(duì)含量顯著升高；在20和80 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH相對(duì)含量顯著降低.N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理PAC2細(xì)胞24 h和36 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致：在1.25 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH含量顯著下降；在5 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH含量沒(méi)有顯著變化；在80 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH含量顯著升高.棕櫚酰肉堿處理PAC2細(xì)胞24 h和36 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在1.25、20、80 μg/mL質(zhì)量濃度下細(xì)胞內(nèi)總LDH相對(duì)含量均極顯著降低，但5 μg/mL的質(zhì)量濃度下僅24 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)總LDH含量有顯著降低.

A: 24 h LDH 分析; B: 36 h LDH 分析. 與對(duì)照組比較，1)P<0.01；2)P<0.05.A: 24 h LDH assay; B: 36 h LDH assay. Compared with control group, 1)P<0.01; 2)P<0.05.

2.3 線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

線粒體和溶酶體對(duì)細(xì)胞能量和脂類(lèi)代謝以及維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用，在很多疾病中都觀察到他們的功能缺陷.線粒體和溶酶體通過(guò)RAB7 GTP酶的作用相互交流，對(duì)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的完整功能具有重要作用[13].為了進(jìn)一步驗(yàn)證4種脂類(lèi)物質(zhì)是否會(huì)影響PAC2細(xì)胞中溶酶體和線粒體的形態(tài)，本研究分別用溶酶體和線粒體專(zhuān)屬染料對(duì)質(zhì)量濃度為80 μg/mL的4種脂類(lèi)處理后的PAC2細(xì)胞進(jìn)行染色.結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組的溶酶體和線粒體均呈現(xiàn)單層完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)；N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯組的溶酶體和線粒體與對(duì)照組相似，呈現(xiàn)單層完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)；C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸組溶酶體發(fā)生粘連，線粒體拖著一個(gè)纖長(zhǎng)的尾巴；磷酰膽堿組的溶酶體出現(xiàn)粘連和聚集，線粒體發(fā)生聚集且由橢圓形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?；棕櫚酰肉堿組溶酶體出現(xiàn)粘連，線粒體的體積變大(圖5).

嵌入圖是細(xì)胞的放大圖. 標(biāo)尺:50 μmInsets show magnification of individual cells. Scalebar: 50 μm.

3 討論

脂類(lèi)物質(zhì)不僅為機(jī)體提供能量，而且參與細(xì)胞發(fā)育及凋亡等多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié).河蟹可食用部分的脂類(lèi)物質(zhì)含量豐富，對(duì)人類(lèi)健康有益的生物活性物質(zhì)和功能性成分也越來(lái)越受到研究者的關(guān)注.

神經(jīng)酰胺-1-磷酸(ceramide-1-phosphate, C1P)是神經(jīng)酰胺經(jīng)過(guò)神經(jīng)酰胺激酶(ceramide kinase, CERK)磷酸化合成的具有生物活性的鞘脂類(lèi).C1P是細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、遷移和炎癥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14-15]. 一些資料表明C1P通過(guò)刺激DNA的合成和細(xì)胞分裂促進(jìn)有絲分裂，同時(shí)抑制絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyltransferase, SPT)活性和神經(jīng)酰胺積累而抑制細(xì)胞凋亡[16-18].本實(shí)驗(yàn)用胚胎成纖維細(xì)胞試驗(yàn)，結(jié)果表明C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸抑制細(xì)胞增殖，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性.特別在20 μg/mL及以上質(zhì)量濃度時(shí)，胞外LDH含量增高，胞內(nèi)LDH含量降低，同時(shí)使亞細(xì)胞水平的線粒體和溶酶體形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變.這些結(jié)果說(shuō)明C-8神經(jīng)酰胺-1-磷酸的作用可能具有組織細(xì)胞特異性.

N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯可以特異性誘導(dǎo)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的凋亡，并且在較低質(zhì)量濃度下有明顯的劑量依賴(lài)性.除了細(xì)胞毒性的作用外，還可以改變?nèi)梭w的細(xì)胞循環(huán)和新陳代謝[19].有報(bào)道稱(chēng)來(lái)自綠膿桿菌的3-oxo-N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯具有促凋亡的活性[20].在本實(shí)驗(yàn)中，N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯處理的PAC2細(xì)胞，其胞外LDH的釋放以及胞內(nèi)總LDH含量都增加，說(shuō)明N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯促進(jìn)細(xì)胞糖酵解代謝的同時(shí)改變了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的通透性.結(jié)合胞內(nèi)和胞外LDH含量的變化，以及CCK-8在24和36 h出現(xiàn)相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明N-十二烷醇-L-高絲氨酸內(nèi)酯增強(qiáng)糖酵解代謝和乳酸生成，并且逐漸抑制線粒體的有氧氧化.

磷酰膽堿是磷脂酶A2的抑制劑[21]，但磷酰膽堿的細(xì)胞毒性活性尚不清楚，其對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的研究鮮有報(bào)道.在本研究中，磷酰膽堿表現(xiàn)為抑制細(xì)胞增殖和增加胞外LDH釋放，說(shuō)明磷酰膽堿對(duì)細(xì)胞膜有一定程度的損壞，同時(shí)能改變線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu).

棕櫚酰肉堿可以促進(jìn)脂肪酸在氧化過(guò)程中從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體中.Tominaga等[22]的研究表明過(guò)量的外源性棕櫚酰肉堿-長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸中間體可能在棕櫚酰肉堿和棕櫚酰輔酶A之間以不同方式擾亂線粒體的功能.Vescovi等[23]的研究表明棕櫚酰肉堿以劑量依賴(lài)性的方式抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng).本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明棕櫚酰肉堿抑制細(xì)胞增殖并且存在劑量依賴(lài)性，并使線粒體和溶酶體的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這與先前的研究結(jié)論一致.同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也表明，棕櫚酰肉堿對(duì)細(xì)胞膜的損傷有嚴(yán)格的質(zhì)量濃度限制.

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平相互驗(yàn)證4種脂類(lèi)對(duì)PAC2細(xì)胞的影響.CCK-8檢測(cè)利用細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶能將檢測(cè)試劑內(nèi)的唑鹽還原成橙黃色的甲瓚，甲瓚的生成量與脫氫酶的活性呈正相關(guān).因此，對(duì)甲瓚溶液進(jìn)行比色測(cè)定即可檢測(cè)細(xì)胞毒性和細(xì)胞增殖[24].LDH 存在于細(xì)胞漿中[25]，膜結(jié)構(gòu)改變常會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞膜完整性受損和滲漏現(xiàn)象，通過(guò)檢測(cè)胞外LDH釋放的活性可以評(píng)估細(xì)胞膜的受損程度.同時(shí)LDH與惡性腫瘤密切相關(guān)，Warburg效應(yīng)是腫瘤細(xì)胞能量代謝的重要特征之一，Warburg效應(yīng)不僅增強(qiáng)了糖酵解作用，同時(shí)通過(guò)將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸來(lái)抑制線粒體的氧化磷酸化.缺氧情況下，惡性腫瘤細(xì)胞中的LDH催化丙酮酸生成乳酸，使糖酵解速率提升，形成的酸性微環(huán)境對(duì)LDH形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[26-28].本實(shí)驗(yàn)利用CCK-8檢測(cè)和胞內(nèi)胞外LDH檢測(cè)，一方面可以反映細(xì)胞數(shù)量的變化，另一方面可以評(píng)估葡萄糖分解途徑：糖酵解和三羧酸循環(huán)有氧氧化比例.另外，通過(guò)線粒體和溶酶體結(jié)構(gòu)檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞膜穩(wěn)定性和線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)能量代謝的變化.

綜上所述，河蟹肝胰腺中的4種脂類(lèi)物質(zhì)對(duì)PAC2細(xì)胞所表現(xiàn)出的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性與細(xì)胞線粒體和溶酶體形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性之間存在一定的聯(lián)系，揭示它們具有明顯的生物活性，能影響細(xì)胞代謝和生長(zhǎng).顯示天然活性物質(zhì)應(yīng)用于臨床治療的可能性，促進(jìn)了河蟹脂類(lèi)活性物質(zhì)研究的發(fā)展.進(jìn)一步研究這些脂類(lèi)對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響將有助于揭示它們的生物活性作用機(jī)制.

致謝:感謝上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院和神經(jīng)科學(xué)研究所的老師和同學(xué)，以及吳昊、劉益寧老師和朱雙光同學(xué)對(duì)本實(shí)驗(yàn)課題研究上的技術(shù)幫助.