張躍偉， 孫鎖柱， 張丹， 謝靜， 張蓉， 李長(zhǎng)政

(1.錦州醫(yī)科大學(xué) 火箭軍總醫(yī)院 研究生培訓(xùn)基地, 遼寧 錦州 121001； 2.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 病理科, 北京 100088； 3.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 消化科, 北京 100088； 4.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 中醫(yī)科, 北京 100088)

放射性腸炎是腹盆腔放療患者的主要健康問(wèn)題，近年來(lái)隨著結(jié)直腸和婦科腫瘤放療患者的增多，發(fā)病率也呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì).放射性腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、微血管損傷、炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)、免疫屏障破壞及腸道菌群失調(diào)等多個(gè)方面[1-2].其中微血管損傷是放射性腸炎的重要發(fā)病機(jī)制之一，主要表現(xiàn)為微血管結(jié)構(gòu)破壞、數(shù)目減少密度下降、微血管硬化、新生血管異常生長(zhǎng)等[3-4].目前對(duì)急性放射性腸炎的研究主要集中在細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)方面，而微血管損傷相對(duì)較少.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察輻射后第1、7、14天不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組小鼠小腸組織中核轉(zhuǎn)錄因子kappaB(nuclear factor kappa B，NF-κB)、血管間粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1)基因mRNA表達(dá)變化，探討上述基因在急性放射性腸炎微血管損傷中的生物學(xué)意義以及氨磷汀對(duì)微血管損傷的保護(hù)機(jī)制，為臨床早期診治提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

清潔級(jí)健康C57BL/10J小鼠84只，3月齡，雌雄各半，雌鼠體質(zhì)量(20±2)g，雄鼠體質(zhì)量(28±2)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供.將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組，輻射后第1、7、14天3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組和輻射后第1、7、14天3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的氨磷汀干預(yù)組，共7組，每組小鼠12只.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

固定組織RNA提取試劑盒，由康為世紀(jì)生物科技有限公司提供；Green qPCR MasterMix (LowROX)試劑盒由BIOMED公司提供；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，由賽默飛世爾公司提供.

1.3 輻射方法

60Coγ-輻照裝置(型號(hào)：GM-11-03-A)對(duì)實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行一次性6 Gy輻射，小鼠籠置于距輻射源小于30 cm距離內(nèi)，輻射劑量率為1.00 Gy/min，總時(shí)長(zhǎng)6 min.干預(yù)組小鼠于輻射前30 min腹腔注射氨磷汀，按人體給藥用量換算，每千克體質(zhì)量小鼠給予質(zhì)量200 mg氨磷汀.

1.4 標(biāo)本制作和病理切片

分別于輻射后第1、7、14天頸椎脫臼法分批處死實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組小鼠，第14天處死對(duì)照組小鼠，取出小腸，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗至無(wú)糞便殘留，剪切分段，分別置于體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林中固定和-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?病理切片：常規(guī)脫水、透明、包埋、石蠟包埋、組織切片和染色.

1.5 定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)

參照固定組織RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA.參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.反應(yīng)體系為：2×Green qPCR MasterMix 10 μL、10×Low ROX dye 2 μL、Forward Primer (濃度10 μmol/L) 0.5 μL、Reverse Primer (濃度10 μmol/L) 0.5 μL、DNA 2 μL、water 5 μL，共20 μL.反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min→(95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s)×40個(gè)循環(huán)→95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 15 s.兩步法進(jìn)行Q-PCR，GAPDH為內(nèi)參.GAPDH引物：上游5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3′、下游5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3′；NF-κB引物：上游5′-CAAGATCTGCCGAGTAAACC-3′、下游5′-TCGGAACACAATGGCCACTT-3′；VCAM-1引物：上游5′-GATAGACAGCCCACTAAACG-3′、下游5′-TGGAGCCAAACACTTGAC-3′；ICAM-1引物：上游5′-TCAGGTATCCATCCATCCCA-3′、下游5′-CGG-TGCCACAGTTCTCAAAG-3′.引物由天一輝遠(yuǎn)科技有限公司提供.

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS23統(tǒng)計(jì)軟件.采用Student′st檢驗(yàn)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 病理改變

光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組小鼠小腸黏膜下微血管規(guī)律出現(xiàn)，結(jié)構(gòu)完整；輻射后第1天實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組均可見(jiàn)微血管充血、擴(kuò)張、紅細(xì)胞溢出等改變，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.選取1張有代表性圖片與對(duì)照組比較，見(jiàn)圖1.第7天實(shí)驗(yàn)組黏膜下層微血管數(shù)量明顯減少，血管壁變薄、破壞，干預(yù)組剩余血管數(shù)量多于實(shí)驗(yàn)組，且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，見(jiàn)圖2.第14天實(shí)驗(yàn)組黏膜下層微血管進(jìn)一步減少，階段性消失，結(jié)構(gòu)完整的微血管罕見(jiàn)，黏膜、膜下結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞數(shù)目減少，干預(yù)組無(wú)微血管階段性消失現(xiàn)象，仍可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的微血管,見(jiàn)圖3.

A：對(duì)照組；B：輻射后第1天實(shí)驗(yàn)組；C：輻射后第1天干預(yù)組. 對(duì)照組小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜下層微血管規(guī)律出現(xiàn)；實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組均可見(jiàn)黏膜下微血管擴(kuò)張充血，兩組無(wú)明顯差異.

A：Control group; B：Experimental group on the first day after radiation; C：Intervention group on the first day after radiation. In the control group, the structure of the small intestine was clear, and the microvascular of the submucosa appeared regularly. Submucosal microvascular dilatation and hyperemia were observed in both the experimental group and the intervention group. There was no significant difference between the two groups. Select a representative image to compare with the control group.

圖1 對(duì)照組和輻射后第1天實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組H.E.染色結(jié)果(×400)

Fig.1 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the first day after radiation (×400)

A：對(duì)照組；B：輻射后第7天實(shí)驗(yàn)組；C：輻射后第7天干預(yù)組. 實(shí)驗(yàn)組黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞，微血管數(shù)量明顯減少，部分區(qū)域微血管消失; 干預(yù)組第7天黏膜下層結(jié)構(gòu)破壞較輕，剩余微血管數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組多，且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，血管壁較厚.

A：Control group; B：Experimental group on the 7th day after radiation; C：Intervention group on the 7th after radiation. In the experimental group, the submucosal structure was destroyed, the number of microvessels was significantly reduced, and the microvessels in some areas disappeared. In the intervention group, the submucosal structure was less damaged, and the number of remaining microvessels was more than that in the experimental group. The structure of the microvessels was relatively complete and the vessel wall was thick.

圖2 對(duì)照組和輻射后第7天實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組H.E.染色結(jié)果(×200)

Fig.2 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the 7th day after radiation (×200)

A：對(duì)照組；B：輻射后第14天實(shí)驗(yàn)組；C：輻射后第14天干預(yù)組. 實(shí)驗(yàn)組黏膜下層正常結(jié)構(gòu)紊亂消失，微血管數(shù)量進(jìn)一步減少，階段性消失，正常結(jié)構(gòu)的微血管罕見(jiàn); 干預(yù)組黏膜下層結(jié)構(gòu)紊亂輕，微血管數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組多，結(jié)構(gòu)完整的微血管多見(jiàn)，無(wú)階段性微血管消失現(xiàn)象.

A：Control group; B：Experimental group on the 14th day after radiation; C：Intervention group on the 14th after radiation. The normal structure of the submucosa in the experimental group was disordered or even disappeared. The number of microvessels is further reduced, and even a phased disappearance occurs. Microvascular with normal structure is rare. In the intervention group, the submucosal structure was less disordered, and the number of microvessels was more than that in the experimental group. The microvessels with complete structure were more common, and there was no phase microvessels disappearance.

圖3 對(duì)照組和輻射后第14天實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組H.E.染色結(jié)果(×200)

Fig.3 H.E. staining results of control group and experimental group and intervention group on the 14th day after radiation (×200)

2.2 Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

各組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因不同CT值的擴(kuò)增曲線平行性良好，其傾斜程度基本一致，說(shuō)明目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致.上述各目的基因和內(nèi)參基因熔解曲線均在對(duì)應(yīng)熔解溫度上形成明顯單峰，說(shuō)明產(chǎn)物特異性良好.在對(duì)照組和各不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組、干預(yù)組中分別選取一條代表性擴(kuò)增曲線和熔解曲線(圖4～9).

2.3 輻射后實(shí)驗(yàn)組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)水平時(shí)間變化及組間比較

(1)輻射后實(shí)驗(yàn)組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)水平時(shí)間變化見(jiàn)圖10.結(jié)果顯示輻射后第1天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的14.86(P=0.000)、7.49(P=0.000)、9.65(P=0.000)倍；第7天相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的9.82(P=0.000)、3.61(P=0.001)、4.44(P=0.000)倍，表達(dá)水平均下降但仍高于對(duì)照組；第14天均降至對(duì)照組水平(P>0.05).

(2)輻射后干預(yù)組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)水平時(shí)間變化見(jiàn)圖11.結(jié)果顯示輻射后第1天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，相對(duì)表達(dá)量分別為對(duì)照組的7.25(P=0.000)、4.23(P=0.000)、6.43(P=0.000)倍；第7天相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的2.10(P=0.001)、1.32(P=0.082)、1.19(P=0.176)倍，NF-κB仍高于對(duì)照組，VCAM-1、ICAM-1達(dá)到對(duì)照組水平；第14天均與對(duì)照組表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

(3)實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組比較見(jiàn)圖12～14.結(jié)果顯示輻射后第1天干預(yù)組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)水平均明顯低于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)應(yīng)P值分別為P=0.000、P=0.001、P=0.013；第7天表達(dá)水平同樣低于實(shí)驗(yàn)組，對(duì)應(yīng)P值分別為P=0.000、P=0.000、P=0.001；第14天干預(yù)組、實(shí)驗(yàn)組均和對(duì)照組表達(dá)水平無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05).

圖4 實(shí)驗(yàn)組NF-κB基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖5 實(shí)驗(yàn)組VCAM-1基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖6 實(shí)驗(yàn)組ICAM-1基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖7 干預(yù)組NF-κB基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖8 干預(yù)組VCAM-1基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖9 干預(yù)組ICAM-1基因Q-PCR擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖10 輻射后實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Fig.10 Changes of relative expression ofNF-κB,VCAM-1andICAM-1mRNA at different time points in the experimental group after irradiation

圖11 輻射后干預(yù)組不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量變化

Fig.11 Changes of relative expression ofNF-κB,VCAM-1andICAM-1mRNA at different time points in the intervention group after irradiation

圖12 輻射后實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組NF-κB基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Fig.12 Comparison of relative expression ofNF-κBmRNA in experimental group and intervention group after radiation

圖13 輻射后實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組VCAM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Fig.13 Comparison of relative expression ofVCAM-1mRNA in experimental group and intervention group after radiation

圖14 輻射后實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組ICAM-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

Fig.14 Comparison of relative expression ofICAM-1mRNA in experimental group and intervention group after radiation

3 討論

早期研究表明，輻射可導(dǎo)致多種微血管病理學(xué)改變，包括毛細(xì)血管不規(guī)則擴(kuò)張，不對(duì)稱(chēng)和閉塞性纖維化以及從輕微增厚到破碎的基底膜變化等[5].放射性腸炎在內(nèi)鏡下常表現(xiàn)出黏膜下小血管網(wǎng)減少、消失，甚至局部腸壁蒼白、僵硬，伴有周?chē)⊙墚惓U(kuò)張，匯聚成簇的“血管集簇”征象[6].這些特征表明微血管的損傷在放射性腸炎中扮演重要角色.但目前對(duì)輻射后微血管損傷的研究多集中在慢性放射性腸炎方面，急性放射性腸炎的微血管改變及其機(jī)制研究相對(duì)較少.同時(shí)氨磷汀作為廣譜放療細(xì)胞保護(hù)劑，對(duì)輻射后微血管損傷的保護(hù)機(jī)制研究也較少.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察對(duì)比急性放射性腸炎小鼠實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組的小腸病理學(xué)改變及NF-κB通路和VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)變化，探討了急性放射性腸炎微血管損傷的特征、機(jī)制及氨磷汀對(duì)微血管保護(hù)的相關(guān)機(jī)制.

本實(shí)驗(yàn)病理學(xué)觀察表明急性放射性腸炎的微血管損傷主要表現(xiàn)為通透性增加，隨后破壞微血管密度下降，階段性消失.早期Dimitrievich等[7]的研究表明，直徑小于10 nm的小毛細(xì)血管比直徑大于10 nm的較大血管具有更高的輻射敏感性.微血管損傷機(jī)制涉及微血管內(nèi)皮損傷，DNA損傷和多種炎癥和促纖維化細(xì)胞因子的釋放.其中毛細(xì)血管和小血管內(nèi)皮損傷和功能障礙在輻射損傷中起著特別重要的作用[8].VCAM-1和 ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員，是血管炎癥期間由內(nèi)皮分泌的關(guān)鍵分子[9].正常情況下VCAM-1、ICAM-1在血管內(nèi)皮表達(dá)量很低，炎癥發(fā)生時(shí)在腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等多種細(xì)胞因子觸發(fā)下表達(dá)迅速上調(diào)，可通過(guò)介導(dǎo)白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與炎癥反應(yīng)[10-12].血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VCAM-1可粘附白細(xì)胞上表達(dá)的α4β1整合素，并激活活化的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)允許白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移的信號(hào)通路，在白細(xì)胞聚集中發(fā)揮作用[13].VCAM-1、ICAM-1可作為血管內(nèi)皮損傷的指標(biāo)，主要通過(guò)NF-κB途徑進(jìn)行表達(dá)調(diào)控[14].NF-κB為作用廣泛的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可通過(guò)輻射等多種途徑活化，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子基因的表達(dá)[15].VCAM-1、ICAM-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有NF-κB的作用結(jié)合位點(diǎn)，活化的NF-κB可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1、ICAM-1的基因表達(dá)，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)[16].本實(shí)驗(yàn)中輻射后第1天實(shí)驗(yàn)組NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)均同步升高，第7天實(shí)驗(yàn)組仍呈高表達(dá)，第14天表達(dá)降至對(duì)照組水平.第7天和14天組織學(xué)可觀察到微血管破壞、數(shù)量減少、階段性消失等現(xiàn)象.NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)高峰為輻射后第1天，組織學(xué)損傷的高峰為第14天，組織學(xué)損傷與基因表達(dá)在時(shí)間上存在滯后性，符合從分子學(xué)改變到組織學(xué)改變的規(guī)律.本實(shí)驗(yàn)表明輻射可激活NF-κB通路進(jìn)而激活VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)，后者可能通過(guò)參與微血管炎癥反應(yīng)在微血管損傷中發(fā)揮作用.

氨磷汀是具抗輻射活性的化合物WR-1605的硫代磷酸酯衍生物，可通過(guò)清除自由基、減少細(xì)胞凋亡等機(jī)制對(duì)正常細(xì)胞起到保護(hù)作用[17].另有研究表明[18-20]，氨磷汀通過(guò)不依賴(lài)于其自由基清除特性的機(jī)制保護(hù)血管免受放射線的影響.其機(jī)制可能為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)新生血管增殖，增加微血管數(shù)量等.本實(shí)驗(yàn)中氨磷汀干預(yù)組輻射后第1天、第7天NF-κB、VCAM-1、ICAM-1基因mRNA表達(dá)均顯著低于實(shí)驗(yàn)組，且下降速度顯著高于實(shí)驗(yàn)組.組織學(xué)觀察提示輻射后第7天和第14天干預(yù)組存留微血管數(shù)量均多于實(shí)驗(yàn)組，且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，這種表現(xiàn)隨時(shí)間延長(zhǎng)變得更加明顯.這表明氨磷汀可能通過(guò)阻斷NF-κB通路進(jìn)而下調(diào)VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)，減輕輻射后微血管的炎癥反應(yīng)，對(duì)放射性腸炎的微血管損傷起到保護(hù)作用.

綜上，微血管損傷在急性放射性腸炎中發(fā)揮著重要作用.微血管的破壞減少主要發(fā)生在輻射損傷的早期，可能與NF-κB通路介導(dǎo)的微血管炎癥反應(yīng)有關(guān).氨磷汀可能通過(guò)下調(diào)輻射后NF-κB通路表達(dá)，進(jìn)而減少VCAM-1、ICAM-1基因表達(dá)，對(duì)微血管起到保護(hù)作用，從而減輕放射性腸炎的損傷.