韓賽楠 劉 遠 張雨辰 齊 君 李星辰 徐凌宇

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其具體的發(fā)病機制尚不明確[1]，對于銀屑病發(fā)病原因、機制以及治療方案的探索一直是研究的熱點。而miRNA的發(fā)現(xiàn)為銀屑病的研究提供了新的思路。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，參與多種生物學反應，其表達失衡涉及到多種腫瘤、炎癥等疾病[2-4]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-423-5p在銀屑病患者體內(nèi)表達減少[5]，但具體作用及機制尚不明確。為深入研究miR-423-5p在銀屑病中的表達及意義，本研究采用qRT-PCR檢測銀屑病患者外周血中miR-423-5p表達，分析其與銀屑病患者嚴重程度指數(shù)(PASI)評分、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)含量、C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)之間的關系，評價其在銀屑病中的診斷價值，并研究miR-423-5p及其潛在靶基因STAT3對銀屑病外周血單細胞增殖及炎癥水平的影響。

1 資料和方法

1.1 一般資料 所有病例均為滄州市中心醫(yī)院皮膚科尋常型銀屑病患者，樣本量為60例。病例組剔除條件：①既往有心腦血管疾病、自身免疫性疾病等嚴重的系統(tǒng)性疾病、懷孕、哺乳期等；②入院前2個月內(nèi)使用維A酸類藥物、甲氨蝶呤、環(huán)孢素、糖皮質激素類藥物等全身治療藥物和依那西普等生物制劑；③入院前1個月內(nèi)使用紫外線照射等物理療法?；颊卟∏樵u分參照銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(psoriasis area and severity index，PASI)標準，包括皮損面積評分和皮損嚴重程度評分。PASI總分=0.1×頭部面積分×頭部嚴重度評分+0.3×軀干面積分×軀干嚴重度評分+0.2×上肢面積分×上肢嚴重度評分+0.4×下肢面積分×下肢嚴重度評分。

選擇滄州市中心醫(yī)院體檢中心的健康體檢者40名為健康對照組，排除自身免疫疾病、心腦血管疾病、癌癥、免疫缺陷病等嚴重的系統(tǒng)性疾病、懷孕等。對銀屑病患者和健康對照的基線資料進行分析，結果見表1。

1.2 標本的采集與處理 所有銀屑病患者入院第一天和健康對照在清晨時抽取靜脈血，采用Trizol法提取血漿總RNA，行RT反應。按試劑盒(superscript II reverse transcriptase, Invitr-ogen公司)說明，采用Oligo(dT)逆轉錄合成cDNA。熒光定量PCR反應，檢測各樣本中的miR-423-5p的相對表達水平。

表1 銀屑病患者和健康對照基本臨床資料

1.3 細胞分離培養(yǎng) 抽取健康對照和銀屑病患者外周血10 mL于EDTA抗凝管中，通過Ficoll-Paque密度梯度離心(GE Healthcare Biosciences)從全血樣品中分離單個核細胞(PBMC)。細胞均用含10%FBS(Hyclone公司)的RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone公司)，在37℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC，日本SANYO)中進行常規(guī)的培養(yǎng)。

免疫學及生化指標檢測 采用Image 800型全自動免疫分析儀(美國貝克曼公司生產(chǎn))及其原裝試劑，檢驗CRP，應用Greiner bioone型全自動血沉儀，檢驗ESR。采用全自動血生化分析儀檢測ALB、TP含量。

1.4 血清炎癥因子檢測 IL-10，IL-12、SIL-2R水平測定參照ELSIA試劑盒(ADI,Texas,USA)說明書進行，用酶標儀(spectraMAX 340, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)在450 nm波長處測定各孔的吸光度，根據(jù)標準曲線定量。

1.5 MTT法測細胞增殖 取各組PBMC細胞接種于96孔板，每孔5×103個細胞。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后，取出培養(yǎng)板，加入MTT溶液(5 mg/mL，Sigma-Aldrich)，培養(yǎng)4 h。去除MTT溶液后，將150μL DMSO(Sigma-Aldrich)添加到每個孔中。搖動10 min后，使用酶標儀測量570 nm波長下的光密度(OD570)。實驗進行了三次。

1.6 細胞轉染 STAT siRNA(siRNA1、siRNA2)和陰性對照(si-NC)，miR-423-5p mimics和陰性對照(mimics NC)，miR-423-5p inhibitor和陰性對照(inhibitor NC)購自GenePharma(中國上海)。細胞轉染嚴格按照說明書操作，使用轉染試劑Lipofectamine 3000(L3000015，Thermo Fisher Scientific)進行細胞轉染。轉染48 h后收集細胞。

1.7 qRT-PCR檢測 取待測細胞，使用TRIZOL試劑(Invitrogen公司)提取各樣品中的總RNA。PCR擴增儀進行逆轉錄反應合成cDNA模版，應用ABI7500定量PCR儀進行Real-time quantitative RT-PCR實驗，逆轉錄引物來自TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒，反應條件為95℃預變性3 min，95℃變性15 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。采取手動方式將閾值選定在各對數(shù)擴增曲線平行上升的最低點，得到各反應管的Ct值(Threshold cycle)，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進行分析，2-ΔΔCt表示實驗組與對照組目的基因表達的倍比關系，公式如下:ΔΔCt=[Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)]實驗組-[Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)]對照組。Ct為反應的實時熒光強度達到設定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，此時擴增是呈對數(shù)期增長。U6為miR-423-5p的內(nèi)參，β-actin為STAT3內(nèi)參，實驗重復3次。各基因及其引物的擴增引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表2。

表2 引物序列

1.8 Western blot檢測 取各組細胞，用預冷的PBS緩沖液洗滌3次，按照10 μL沉淀加入100 μL蛋白抽提裂解液，劇烈渦旋震蕩混勻5 s，將細胞沉淀重懸并使其均勻分散，冰上放置15 min。4℃，12000 rpm，離心10 min，吸取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-80℃保存。將裂解的蛋白樣品，采用BCA試劑盒(ThermoFisher Scientific)進行蛋白濃度的測定。取適量提取的蛋白樣品加入5×Loading buffer，水中煮沸10 min，進行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳時先調節(jié)電壓為60 V，待蛋白進入分離膠(約20 min)后，改用120 V，電泳1～2 h，4℃冷室中進行。電泳結束后，用濕轉電轉移法將蛋白質轉移到PVDF膜上，小心排凈氣泡，轉膜2 h，4℃冷室中進行，取下PVDF膜，5% 脫脂牛奶-TBST封閉，室溫搖床振蕩2 h。封閉結束后，以洗膜液漂洗PVDF膜，加入兔抗人GAPDH(1∶1000，ab9485，Abcam)、STAT3(1∶2000，4695，CST)，4℃過夜搖床振蕩孵育，TBST洗3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1∶10000，Sigma 公司)，室溫振蕩孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。進行化學發(fā)光顯色，曝光、顯影、定影，數(shù)據(jù)分析。內(nèi)參為GAPDH。

1.9 熒光素酶報告基因實驗 通過在線預測軟件Target Scan確定STAT3和miR-423-5p結合的靶位點，根據(jù)預測結果，分別設計STAT3和miR-423-5p結合位點的突變序列和野生序列。將突變序列和野生序列片段克隆并與Promega載體結合，使用突變序列結合miR-423-5p mimics或miR-499a-5p陰性對照物分別共轉染SH-SY5Y細胞，并分別命名為MT+miR-423-5p mimics組，MT+NC組。此外，野生序列結合miR-423-5p mimics或miR-423-5p陰性對照物分別共轉染PBMC細胞，并分別設置為WT+miR-423-5p mimics組，WT+NC組。轉染48小時后，使用熒光素酶試劑盒(購自北京原平皓生物技術有限公司)檢測各組細胞的熒光活性強度。

1.10 RNA Pull-down測定 miR-423-5p，miR-423-5p突變體(miR-423-5p MUT)及其陰性對照購自GenePharma(中國上海)。使用Biotin RNA Labeling Mix(Roche，Basel，Switzerland)和T7/SP6 RNA聚合酶(Roche)對miRNA進行生物素標記。將全細胞裂解物混合并與生物素化的RNA一起溫育。然后將復合物與鏈霉抗生物素蛋白瓊脂糖珠(Invitrogen)在37℃溫育1 h。洗滌珠子并通過qRT-PCR分析RNA。

1.11 統(tǒng)計學方法 SPSS 22.0和GraphPad.Prism.v7.01統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標準差)來表示，兩組間的比較采用t檢驗，多組間采用One-Way ANOVA單因素方差分析，AVOVA分析后的兩兩比較采用Tukey’s multiple comparisons test。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用ROC曲線評價miR-423-5p在血漿中的表達對銀屑病的診斷價值。通過正態(tài)性檢驗確定PASI得分的偏正態(tài)分布。

2 結果

2.1 miR-423-5p在銀屑病中低表達 qRT-PCR檢測健康志愿者和銀屑病患者血漿中miR-423-5p，結果發(fā)現(xiàn)，與健康組相比，銀屑病組血漿中miR-423-5p表達水平顯著降低(p<0.001)(圖1a)，為了進一步研究miR-423-5p是否可能成為評估銀屑病患者的潛在標志物，我們對miR-423-5p與臨床病理數(shù)據(jù)進行了相關性分析，結果顯示(圖1b～1f)，銀屑病患者miR-423-5p表達水平與PASI評分、CRP、ESR呈負相關(P<0.0001)，與TP、ALB呈正相關(P<0.0001)。在此基礎上，我們進一步采用ROC曲線來評價miR-423-5p在銀屑病中的診斷價值，結果顯示(圖1g)，ROC曲線下的面積為0.8675，這些結果表明，miR-423-5p在銀屑病中表達下調并且可以作為評價銀屑病的一種生物標志物。

1a：qRT-PCR檢測健康組和銀屑病組血漿中miR-423-5p表達水平,***表示P<0.001；1b～1f：miR-423-3p表達水平與PASI評分、TP、ALB、CRP、ESR的相關性分析；1g：ROC曲線

圖1miR-423-5p在銀屑病患者血漿中的表達水平及臨床意義

2.2 銀屑病患者炎癥因子水平升高 ELSIA實驗結果表明銀屑病患者血漿中SIL-2R、IL-10及IL-12表達較健康者均顯著升高(P<0.001，圖2a)。對銀屑病患者血漿中miR-423-5p表達水平和SIL-2R、IL-10及IL-12表達水平進行相關性分析，結果表明銀屑病患者血漿中miR-423-5p表達水平與SIL-2R、IL-10及IL-12表達水平均呈負相關(圖2b)。

2a：ELISA檢測健康受試者和銀屑病患者血漿中SIL-2R、IL-10及IL-12表達水平，***表示P<0.001；2b：銀屑病患者血漿中miR-423-5p表達水平和SIL-2R、IL-10及IL-12表達水平相關性分析

圖2銀屑病患者血漿炎性因子的表達水平

2.3 miR-423-5p抑制PBMC細胞增殖，降低細胞炎癥水平 我們在銀屑病患者血漿中檢測到miR-423-5p水平降低，為了研究miR-423-5p在銀屑病中的作用，用miR-423-5p mimics和miR-423-5p inhibitor轉染PBMC細胞(圖3a)，檢測PBMC細胞的增殖及炎癥水平。MTT檢測結果(圖3b)顯示，miR-423-5p mimics能夠明顯降低PBMC細胞的增殖能力，而miR-423-5p inhibitor則顯著促進PBMC細胞增殖。ELISA檢測炎癥水平(圖3c)，結果表明miR-423-5p mimics顯著抑制了炎癥因子的表達，miR-423-5p inhibitor組炎癥水平則明顯升高。

3a：PBMC細胞中miR-423-5p表達水平；3b：MTT檢測PBMC細胞增殖；3c：ELISA檢測PBMC細胞中SIL-2R、IL-10及IL-12表達水平。與Mock組相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001

圖3miR-423-5p抑制銀屑病PBMC細胞增殖和炎癥表達

2.4 STAT3是miR-423-5p的靶基因 銀屑病患者血漿中STAT3高表達，miR-423-5p與STAT3表達水平呈負相關(圖4a、4b)，我們進一步通過Targetscan在線預測miR-423-5p與STAT3的靶向關系，結果顯示，STAT3與miR-423-5p的結合位點為3’-UTR區(qū)(圖4c)；雙熒光素酶報告基因檢測顯示(圖4d)，在銀屑病PBMC細胞中，miR-423-5p mimics與STAT3野生型重組載體轉染組熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)；RNA Pull-down實驗進一步證實miR-423-5p可以直接與STAT3結合(圖4e)。

4a：qRT-PCR檢測銀屑病患者和健康對照組STAT3 mRNA表達水平，***表示P<0.001；4b：銀屑病患者PBMC細胞中miR-423-5p表達水平和STAT3 mRNA表達水平的相關性分析；4c：Targetscan預測STAT3和miR-423-5p結合的靶位點；4d：雙熒光素酶報告基因活性檢測，***表示與NC-mimics組相比較，P<0.001；4e：RNA Pull-down分析，***表示與Bio-NC組相比，P<0.001

圖4STAT3是miR-423-5p的靶基因

2.5 STAT3可以消除miR-423-5p在銀屑病PBMC細胞中的作用 為了驗證STAT3是否參與miR-423-5p在銀屑病PBMC細胞增殖及炎癥因子SIL-2R、IL-10、IL-12的表達，我們敲除了銀屑病PBMC中的STAT3，分別采用qRT-PCR、Western blot檢測干擾效率，siRNA1和siRNA2組STAT3 mRNA和蛋白水平均顯著低于Mock組或si-NC組(均P<0.001)(圖5a)。將miR-423-5p inhibitor與si-RNA2共轉染PBMC細胞，檢測銀屑病PBMC細胞的增殖和炎癥水平。結果表明，STAT3的沉默可顯著抑制PBMC細胞的增殖(圖5b)，降低SIL-2R、IL-10、IL-12的表達(圖5c)；與siRNA2組相比，siRNA2+miR-423-5p inhibitor組細胞增殖顯著增多，炎癥水平提高。由上述結果可知STAT3能夠消除miR-423-5p對銀屑病PBMC細胞增殖及炎癥表達的影響。

5a：qRT-PCR和Western blot檢測siRNA對STAT3 mRNA和蛋白水平的敲除效果，***表示Mock組相比，P<0.001；5b：MTT檢測共轉染后PBMC細胞增殖，***表示Mock組相比，P<0.001；###表示與siRNA2組相比，P<0.001;5c：共轉染對炎癥因子的表達的影響，與Mock組相比，**表示P<0.01，***表示P<0.001；與siRNA2組相比，#表示P<0.05，###表示P<0.001

圖5STAT3可以消除miR-423-5p在銀屑病PBMC細胞中的作用

3 討論

銀屑病是一種由環(huán)境因素刺激、多基因遺傳控制、免疫機制介導的皮膚病，其發(fā)病機制還不十分明確，目前為止，尚未有任何一種藥物能夠完全治愈銀屑病或控制復發(fā)[1]。臨床上銀屑病分為4個類型，尋常型最為常見，其他類型多由尋常型轉化而成。通過對銀屑病家系分析，證實銀屑病是多基因復雜遺傳疾病，多個基因相互作用，或者與環(huán)境相互作用，導致發(fā)病，其中包括非編碼小RNA(如miRNA)[2-4]。miRNAs占人類基因組的1%～5%，調控約30%的蛋白表達，是人體內(nèi)種類最多的調節(jié)基因，研究表明miRNA在銀屑病的發(fā)展中起著重要調節(jié)作用[5]。Zibert等[6]研究發(fā)現(xiàn)miR-136高表達于人表皮角質形成細胞，作用于靶基因PPP2R2A，調節(jié)TGF-β1引起的角質形成細胞的增殖，參與銀屑病的發(fā)??；Fu等[7]在對銀屑病患者的PBMCs的研究中發(fā)現(xiàn)在銀屑病患者的CD4 T細胞中miR-138的表達降低，且隨著miR-138表達的降低使得Th1/Th2的比例發(fā)生變化，參與銀屑病的發(fā)病；Ralfkiaer等[8]通過基因芯片及qRT-PCR在慢性炎癥性疾病如銀屑病與皮T細胞淋巴瘤的對比中發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-203、miR-205的表達可以鑒別炎癥性疾病與皮膚T細胞淋巴瘤，并且具有較高的特異性和敏感性。

銀屑病作為慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)展與炎性因子水平及血液學指標聯(lián)系密切。鄧志文[9]研究銀屑病患者血液學指標的變化特點發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者CRP、ESR明顯高于健康人群，張良芬等[10]研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者SIL-2R及IL-12均高于健康人群。本研究檢測了銀屑病患者CRP、ESR及SIL-2R及IL-10、Il-12水平，發(fā)現(xiàn)CRP、ESR及IL-10、Il-12水平顯著高于健康對照，與前人研究成果一致。

近些年，有研究發(fā)現(xiàn)miR-423-5p在骨骼肌[11]、滋養(yǎng)細胞[12]、心肌細胞[13]、卵巢癌[14]、膠質母細胞瘤[15]、前列腺癌[16]等多種疾病中均發(fā)揮著作用。任新新[5]、Huang等[17]發(fā)現(xiàn)在銀屑病中miR-423-5p表達量明顯減少，我們通過qRT-PCR檢測，證實了miR-423-5p在銀屑病患者外周血中的表達相對于健康者顯著下調。通過在線預測軟件Targetscan(http://www.targetscan.org/)發(fā)現(xiàn)STAT3是miR-423-5p的靶基因。有研究[18]發(fā)現(xiàn)STAT3參與銀屑病的發(fā)病及發(fā)展，我們在研究中也發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血中STAT3表達量顯著升高，越來越多的研究也證明STAT3在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用[19,20]。此外我們研究了miR-423-5p對銀屑病外周血單細胞增殖及炎癥水平的影響，發(fā)現(xiàn)miR-423-5p上調后PBMC細胞OD值明顯降低，SIL-2R、IL-10和IL-12水平明顯下降，miR-423-5p下調后PBMC細胞OD值顯著上升，SIL-2R、IL-10和IL-12水平明顯升高。而更加具體的調節(jié)機制需要進一步深入研究。