郭韞懿 祝 英 張丹露 郭碧蓉 孫忠輝
表皮松解性掌跖角皮癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma,EPPK)主要臨床表現(xiàn)是手掌和足趾發(fā)生過(guò)度角化,是一種常染色體顯性遺傳病[1]。目前研究顯示該病是由不同致病基因引起:KRT1、KRT9和KRTl6,因此該病具有遺傳異質(zhì)性。本課題組診斷兩個(gè)表皮松解性掌跖角化癥家系,進(jìn)行了致病基因研究,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 臨床資料 先證者1,男,58歲,工人。因雙掌跖角化50余年,于2015年8月來(lái)我院就診。先證者自4歲起無(wú)明顯誘因雙掌跖部出現(xiàn)對(duì)稱(chēng)性片狀紅斑,角化,形狀不規(guī)則,受累皮膚粗糙增厚,一般無(wú)自覺(jué)癥狀,有時(shí)伴有瘙癢、疼痛。皮疹逐漸向周?chē)鷶U(kuò)展,至15歲時(shí)已累及雙手整個(gè)掌側(cè)及雙足跖,部分皮疹成蠟黃色角化性斑塊;指(趾)甲未見(jiàn)增厚、混濁。23歲后皮疹未再擴(kuò)展。期間雙掌、雙足部皮疹反復(fù)發(fā)作,有一定季節(jié)性,冬重夏輕,伴有足部多汗(圖1a、1b)。家族史:調(diào)查家族中4代人。先證者父母非近親結(jié)婚,外祖父、母親(均已亡)有此病史,先證者兒子正常。符合常染色體顯性遺傳模式。體格檢查:一般情況良好,各系統(tǒng)檢查未見(jiàn)明顯異常。皮膚科檢查:皮疹分布于雙手掌、雙足底部,主要表現(xiàn)為境界清楚的黃色角化斑塊、丘疹,伴脫屑。
先證者2,男,37歲,工人。因雙掌跖角化30余年,于2015年6月來(lái)我院就診。先證者自5歲起無(wú)明顯誘因雙掌跖部出現(xiàn)對(duì)稱(chēng)性片狀紅斑,角化,形狀不規(guī)則,受累皮膚粗糙增厚,通常無(wú)自覺(jué)癥狀,有時(shí)伴有瘙癢、疼痛。皮疹逐漸向周?chē)鷶U(kuò)展,至20歲時(shí)已累及雙手整個(gè)掌側(cè)和雙足跖,部分皮疹成堅(jiān)硬蠟黃色角化斑塊;指(趾)甲未見(jiàn)變形。20歲后皮疹未再擴(kuò)展。期間雙掌,雙足部皮疹反復(fù)發(fā)作,呈角化過(guò)度,脫落,再角化,交替進(jìn)行,有一定季節(jié)性,冬重夏輕。(圖1c、1d)。家族史:調(diào)查家族中3代人。先證者父母非近親結(jié)婚,父親發(fā)病(已亡);目前家族中共有患者3人,其中男2例,女1例。先證者兒子、女兒發(fā)病,符合常染色體顯性遺傳模式。體格檢查:一般情況良好,各系統(tǒng)檢查未見(jiàn)明顯異常。皮膚科檢查:皮疹分布于雙手掌、雙足底部,主要表現(xiàn)為境界清楚的黃色角化斑塊、有皸裂。
兩例先證者病理相似:角化亢進(jìn),表皮增生,顆粒層增厚,棘層肥厚,真皮淺層血管周?chē)∈枇馨徒M織細(xì)胞浸潤(rùn)。顆粒層及棘層未見(jiàn)裂隙及顆粒性空泡變性,未見(jiàn)表皮松解(圖1e、1f)。
1.2 外周血DNA提取 獲得知情并簽署同意書(shū)后,抽取2家系患者及親屬外周血3mL。其中,家系2患者為先證者2和一子、一女。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司,德國(guó))提取基因組DNA,標(biāo)化質(zhì)量濃度至10mg/μ。另外,以同樣的方法提取100名無(wú)親緣關(guān)系的健康個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。
1.3 PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序 通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列,Primer 3.0設(shè)計(jì)KRT1、KRT9和KRT16外顯子特異性引物 (htttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)。PCR擴(kuò)增后,所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接在A(yíng)BI PRISM? 3700測(cè)序儀上測(cè)序(Applied Biosystems)。測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)基因組KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列比較。使用Chromas 2.2軟件進(jìn)行解讀,并用Geneious 11.1進(jìn)行比對(duì)分析。
PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn):患者1家系先證者KRT1基因CDS第598處雜合T堿基成為C堿基,因此編碼的苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼帷<矗篶.598T>C,p.F200L。經(jīng)檢索HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、LOVD(http://www.lovd.nl/3.0/home)數(shù)據(jù)庫(kù)該突變是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道(圖2a)。家系2先證者及子女 KRT9基因CDS第488處雜合T堿基成為A堿基,因此編碼的精氨酸變?yōu)樘於0?。即:c.G488>A,p.R163Q。該突變?yōu)樵摬〕R?jiàn)突變(圖2b)。而兩個(gè)家系的家系內(nèi)正常對(duì)照及家系外100個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的正常人中均不存在此突變。
圖11a、1b:先證者1臨床表現(xiàn);1c、1d:先證者2臨床表現(xiàn);1e、1f:先證者1組織病理可見(jiàn)角化亢進(jìn),表皮增生,顆粒層增厚,棘層肥厚,真皮淺層血管周?chē)∈枇馨徒M織細(xì)胞浸潤(rùn)(HE,×40;×200)
2a、2b:家系1和家系2家系圖;2c、2d:家系1、家系2患者測(cè)序結(jié)果
圖2家系圖和測(cè)序結(jié)果 (箭頭所示為先證者,+表示DNA測(cè)序者)
掌跖角皮癥(palmoplantar keratoderma,PPK)是一組掌跖角化疾病的統(tǒng)稱(chēng),存在二十幾種亞型。根據(jù)臨床癥狀發(fā)生形態(tài)的不同,PPK可以分為3種類(lèi)型:彌漫性、局灶性和點(diǎn)狀性。由于是僅根據(jù)臨床形態(tài)來(lái)分型,而每一型往往致病基因有多個(gè),所以總的來(lái)說(shuō)PPK是遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的一組疾病。EPPK是彌漫性掌跖角皮癥的一個(gè)亞型,OMIM號(hào)為144200。根據(jù)國(guó)際人類(lèi)中間絲數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Intermediate Filament Database,HIFD,http://www.interfil.org/)截止2014年11月22日的數(shù)據(jù)顯示,目前明確的致病基因有KRT1、KRT9 和KRT16。我們雖將KRT16基因列入侯測(cè)基因,但既往僅報(bào)道過(guò)一例EPPK是KRT16突變引起,也僅是罕見(jiàn)的嵌合型[2],目前的文獻(xiàn)表明所有KRT16基因突變與先天性厚甲癥[3]有關(guān)。因此EPPK主要致病基因是KRT1和KRT9。
EPPK屬于常染色體顯性遺傳,多為嬰兒期開(kāi)始發(fā)病,輕者僅有掌跖皮膚粗糙,重者掌跖處出現(xiàn)表皮松解性斑塊狀、邊緣清晰的角質(zhì)增厚,呈黃色胼胝體樣。有時(shí)角質(zhì)增厚可蔓延至掌跖皮膚側(cè)緣或手足背,可伴有指節(jié)墊、甲板增厚渾濁、指趾屈曲畸形等。病理:表皮高度角化過(guò)度,顆粒層及棘層增厚;可有表皮松解,即可見(jiàn)裂隙及顆粒性空泡變性。EPPK與非表皮松解性掌跖角皮癥(NEPPK)本質(zhì)是同一病,因臨床改變是一樣的,且都是KRT1、KRT9突變引起。NEPPK 又名“Thost” 型掌跖角皮癥,早在1880年由Thost 發(fā)現(xiàn)并命名。2002年Kuster等[4]重新檢測(cè)了Thost患者的后裔,結(jié)果組織病理還是顯示有表皮松解。本研究致病突變檢測(cè),家系1先證者的KRT1基因突變p.F200L 2016年Gagliardi[5]已報(bào)道;而家系2的KRT9基因突變p.R163Q是目前國(guó)內(nèi)外均已報(bào)道的熱點(diǎn)突變。雖然兩先證者組織病理都未見(jiàn)表皮松解現(xiàn)象,但結(jié)合臨床癥狀和基因診斷結(jié)果,兩家系患者都診斷為EPPK。
KRT9角蛋白局限性的表達(dá)于掌跖表皮中[6],突變引起的疾病僅是EPPK 。KRT9基因雖然異質(zhì)性不強(qiáng),但存在突變熱點(diǎn)區(qū)和熱點(diǎn)突變。數(shù)據(jù)庫(kù)顯示KRT9基因突變熱點(diǎn)區(qū)位于1A區(qū)前端的157-172個(gè)氨基酸位置。在總共25個(gè)突變中位于1A區(qū)域有20個(gè),位于2B區(qū)僅5個(gè)?;蛲蛔冾l率最高的是第163氨基酸突變,Liu[7]統(tǒng)計(jì)該位置約占所有報(bào)道病例的44%,而p.R163W約占29.33%,其次為p.R163Q約占10%。第163位氨基酸突變可能影響角蛋白中間絲組裝,從而導(dǎo)致EPPK。本研究先證者2家系正是攜帶此突變,因而是明確的EPPK。
相較于KRT9角蛋白,KRT1角蛋白主要表達(dá)在全身表皮的棘層和顆粒層細(xì)胞,其突變可以引起眾多表型。目前顯示除了EPPK,表皮松解性角化過(guò)度型魚(yú)鱗病(EHK)、先天性大皰性魚(yú)鱗病樣紅皮病(BCIE)、周期性魚(yú)鱗病伴表皮松解性角化過(guò)度(CIEH)、豪豬狀魚(yú)鱗病(IHCM)、彌漫性非表皮松解性掌跖角皮癥(NEPPK)、條紋狀掌跖角皮癥(SPPK)、常染色體顯性遺傳腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ADLD)和 Greither綜合征(GS)也與其突變有關(guān)。HIFD數(shù)據(jù)庫(kù)顯示KRT1突變目前有47個(gè),大多數(shù)(32個(gè))是引起表型相對(duì)嚴(yán)重的BCIE,而表型相對(duì)較輕的PPK(包括EPPK,NEPPK)僅有8個(gè),均為錯(cuò)義突變。引起B(yǎng)CIE的突變絕大多數(shù)位于角蛋白1A和2B區(qū)域。KRT1中1A和2B是編碼體內(nèi)角蛋白絲裝配的重要區(qū)域,該區(qū)域改變會(huì)影響角蛋白絲的形成并影響其穩(wěn)定性,進(jìn)而影響角蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成[8]。在8個(gè)引起PPK的突變中,影響的編碼序列分別位于頭、1A、1B和2B區(qū)域,未顯示突變熱點(diǎn)。PPK有遺傳異質(zhì)性,同樣在KRT1基因也表現(xiàn)出了復(fù)雜的臨床異質(zhì)性。KRT1同一突變可在家系內(nèi)引起不同表型,比如Nellen[9]描述一家系攜帶c.1016T>A,4歲先證者是嚴(yán)重的表皮松解EHK。患者不僅有EPPK和屈曲部位的疣狀增厚,還有軀干部位過(guò)度角化和去除鱗屑后的糜爛。而患者家系其他患者僅有EPPK和皮膚摩擦后出現(xiàn)水皰。同樣的,KRT1同一突變可在家系以外引起不同表型。比如國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的一例EPPK[10]與國(guó)外報(bào)道[11]的BCIE和CIEH的致病突變都是KRT1錯(cuò)義突變c.1436T>C。
然而,本研究先證者1的突變p.P200L目前文獻(xiàn)顯示僅一例為意大利報(bào)道[5]。Gagliardi報(bào)道采用外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)一家系中既有進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮綜合征(CMT),又有PPK的患者4例,其他患者單獨(dú)患有CMT或PPK各1例。作者認(rèn)為這兩個(gè)疾病是單獨(dú)引起,致病突變分別是MPZ 基因的p.Ser44Phe 和KRTI基因p.P200L。p.P200L位于1A區(qū)域,經(jīng)蛋白預(yù)測(cè)軟件SIFT Pred、Polyphen 2和 Mutation Taster都認(rèn)為是致病突變。由于其合并其它基因突變、表型復(fù)雜,p.P200L所致EPPK的病情是否發(fā)展、有無(wú)異質(zhì)性,還需隨訪(fǎng)觀(guān)察。我們報(bào)道的也是同一突變PPK家系,符合文獻(xiàn),但無(wú)其它合并基因突變疾病。由于KRT1基因突變存在上文所述的復(fù)雜的臨床異質(zhì)性,所以先證者1還是需要隨訪(fǎng),以觀(guān)察其病情發(fā)展。另外,本突變?cè)谥袊?guó)人群是首例報(bào)道。