黃秋紅 周吉文 趙麗欣 朱靈燕 潘永年

Claudins蛋白是一類跨膜蛋白家族，在人體多種組織中均有表達(dá)，具有維持緊密連接的屏障功能和柵欄功能，若其表達(dá)異?？蓪?dǎo)致上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞，極性喪失，細(xì)胞間黏附力下降，進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生、侵襲與轉(zhuǎn)移[1]。因此，Claudins蛋白與腫瘤的相關(guān)性研究已成為近年來研究的熱點(diǎn)。Claudin-1、7均是Claudins蛋白家族的重要成員，在維持細(xì)胞極性和屏障功能方面起著重要作用。目前為止，Claudins蛋白與皮膚腫瘤的相關(guān)性研究報(bào)道較少。因此，本研究擬通過免疫組織化學(xué)方法檢測Claudin-1、7蛋白在AK和SCC中的表達(dá)，從而初步探討Claudin-1、7在AK和SCC發(fā)病機(jī)制中的作用，為其早期診斷和基因靶向治療建立實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Claudin-1、7 兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自南京凱基生物發(fā)展有限公司。

1.2 樣本資料 收集2014年11月至2016年11月于我院皮膚科就診患者，結(jié)合臨床表現(xiàn)及組織病理確診為AK和SCC各30例，男女比例1∶1，其中SCC組均為高分化鱗癌。正常對(duì)照組30例來源于手術(shù)切除時(shí)所帶的正常皮膚組織。所有標(biāo)本都具有典型或較為典型的皮損，并且通過HE染色證實(shí)均具有典型的病理學(xué)改變。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測組織樣本中Claudin-1、7蛋白的表達(dá) 將所有標(biāo)本按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋、切片，嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行檢測。(1)抗原修復(fù)：先將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)液的燒杯中，高火檔至煮沸，將燒杯取出置于電熱器上保持微沸狀態(tài)20 min，而后將燒杯浸入流水中自然冷卻后用PBS浸洗3次。(2)滅活酶：每張切片滴加2滴3% H2O2-甲醇溶液，室溫封閉10 min。PBS浸洗3次。(3)封閉：滴加即用型山羊血清50～100 μL，室溫孵育20 min。(4)抗原-抗體反應(yīng)：滴加一抗(1∶100稀釋)50～100 μL，37℃，濕盒孵育2 h，PBS浸洗3次。(5)加增強(qiáng)劑：滴加增強(qiáng)劑50 μL，室溫濕盒孵育30 min。PBS浸洗3次。(6)一抗二抗反應(yīng)：滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μL，室溫孵育30 min。PBS清洗3次。(7)顯色、復(fù)染，最后脫水封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 結(jié)果判定 高倍鏡下選取10個(gè)視野，綜合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～35%為1分，35%～65%為2分，>65%為3分。兩者評(píng)分相乘，0～2分為陰性，3～9分均判斷為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析均通過SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行。Claudin-1、7在癌旁正常表皮、AK和SCC中免疫組化陽性率間的比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Claudin-1蛋白在癌旁正常表皮、AK和SCC中的表達(dá) 經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果顯示，在癌旁正常表皮中，Claudin-1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)(100%)，主要定位于角質(zhì)形成細(xì)胞膜上(圖1，表1)；在AK中，Claudin-1蛋白主要表達(dá)于表皮上層細(xì)胞，集中在細(xì)胞膜上，下層細(xì)胞表達(dá)明顯減弱甚至不著色(圖2)；在SCC中，大部分腫瘤細(xì)胞Claudin-1蛋白表達(dá)陰性(圖3)。Claudin-1蛋白在AK和SCC中的陽性表達(dá)率分別為53.33%(16/30)和13.33%(4/30)(表1)，較癌旁正常表皮均明顯降低(P<0.05)，且Claudin-1蛋白在SCC中的表達(dá)水平明顯低于AK(P<0.05)。

表1 癌旁正常表皮、AK和SCC中Claudin-1蛋白表達(dá)陽性率

2.2 Claudin-7蛋白在癌旁正常表皮、AK和SCC中的表達(dá) 經(jīng)免疫組化檢測結(jié)果顯示，Claudin-7蛋白在癌旁正常皮膚組織、AK和SCC中表達(dá)缺如(圖4～6)。

圖1癌旁正常表皮中 Claudin-1蛋白主要定位于角質(zhì)形成細(xì)胞膜上，呈強(qiáng)陽性表達(dá)(免疫組化，×100)圖2AK中Claudin-1蛋白在表皮下層細(xì)胞表達(dá)明顯減弱甚至不著色(免疫組化，×100)圖3SCC中大部分腫瘤細(xì)胞Claudin-1蛋白表達(dá)陰性(免疫組化，×100)

圖4～6 Claudin-7蛋白分別在癌旁正常表皮、AK和SCC中表達(dá)缺如(免疫組化，×100)

3 討論

皮膚覆蓋體表，是機(jī)體內(nèi)、外環(huán)境的分界，也是人體最大的器官，其擔(dān)負(fù)著屏障、吸收、感覺、物質(zhì)代謝、免疫防御等重要功能。Claudin蛋白主要在上皮細(xì)胞相鄰面的胞膜上表達(dá)或分布，以形成細(xì)胞間的緊密連接，其表達(dá)情況直接決定皮膚的完整程度，參與炎癥、腫瘤等疾病的發(fā)生、發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)不同組織器官Claudin蛋白的表達(dá)是不同的，大部分組織器官可有兩種以上Claudin蛋白表達(dá)[2]。本實(shí)驗(yàn)著重研究Claudin-1、7在正常表皮和表皮腫瘤組織中的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示：在正常表皮中Claudin-1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，且主要定位于角質(zhì)形成細(xì)胞膜上，呈棕褐色，該結(jié)果與翁立強(qiáng)等[3]研究結(jié)果基本一致，而Claudin-7在癌旁正常表皮中表達(dá)缺如。

研究表明，Claudin蛋白在腫瘤中的表達(dá)具有組織特異性，且同一種Claudin蛋白在不同腫瘤組織中的表達(dá)或者在同一類型腫瘤的不同病理亞型中的表達(dá)亦各不相同，這種表達(dá)的差異性為腫瘤的診斷、治療均提供了新的思路。Claudin-1、7均是構(gòu)成緊密連接蛋白的重要骨架蛋白，在多種腫瘤中均存在異常表達(dá)，并與腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究證實(shí)，Claudin-1在乳腺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)降低[4，5]，Claudin-7在多種腫瘤中也表達(dá)下降，且下降程度與腫瘤組織學(xué)分級(jí)呈正比，有學(xué)者認(rèn)為它是潛在的腫瘤抑制劑。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中Claudin-7表達(dá)缺失，并與腫瘤病理分級(jí)、TNM分期、血管侵犯、癌細(xì)胞浸潤等有關(guān)[6]。Claudin-7基因敲除可導(dǎo)致食管鱗癌細(xì)胞e-cadherin表達(dá)降低，從而加速腫瘤細(xì)胞的生長和浸潤。Claudin-7基因敲除細(xì)胞具有較高的erk1/2磷酸化水平，但隨著Claudin-7的恢復(fù)，細(xì)胞增殖、侵襲能力和erk1/2磷酸化水平將顯著降低[7]。由此認(rèn)為Claudin-7在抑制腫瘤侵襲和增殖方面具有重要的作用，可能是一個(gè)潛在的治療分子靶點(diǎn)。這些關(guān)于腫瘤中Claudin蛋白表達(dá)減少的報(bào)道與普遍接受的觀點(diǎn)是一致的，即腫瘤的發(fā)生常常伴隨著緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞，表現(xiàn)為癌細(xì)胞黏附力喪失、侵襲性強(qiáng)和分化差等方面。事實(shí)上，許多已發(fā)表的研究報(bào)告也發(fā)現(xiàn)一部分腫瘤中存在Claudin-1、7蛋白的過度表達(dá)。在食管鱗狀細(xì)胞癌中Claudin-1的表達(dá)異常增加，主要分布在腫瘤細(xì)胞核中，并通過AMPK/STAT1/ULK1信號(hào)途徑觸發(fā)自噬，從而促進(jìn)食管鱗癌的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。Claudin-7在肝細(xì)胞癌、未分化和低分化鼻咽癌中的表達(dá)均明顯增加。這種Claudin-7上調(diào)引起的致癌作用可能是其棕櫚酰化后通過與MMPs的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而加速腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[9]?？傊瓹laudin-1、7在不同腫瘤組織中差異性表達(dá)的確切機(jī)制仍不清楚，但已證實(shí)受多種細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

近年來，國外部分學(xué)者已經(jīng)開始關(guān)注Claudin蛋白在皮膚腫瘤中的表達(dá)。Tas等[10]研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤患者的血清Claudin-1水平顯著低于健康人群，但已知的臨床變量，包括患者年齡、性別、病變部位、組織學(xué)、淋巴結(jié)受累、疾病分期、血清乳酸脫氫酶水平和化療反應(yīng)，與血清Claudin-1濃度均無相關(guān)性。另有研究證明Claudin-1的下調(diào)或丟失參與黑素瘤腦轉(zhuǎn)移的形成，它可能是黑素瘤腦轉(zhuǎn)移高危患者的一個(gè)預(yù)測因子[11]。皮膚腫瘤是皮膚科常見的多發(fā)性疾病，其中AK和SCC屬于一個(gè)病譜疾病，前者屬于癌前期病變，有時(shí)可發(fā)展為SCC，后者系起源于角質(zhì)形成細(xì)胞的惡性腫瘤，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，可由各種癌前期疾病演變而來。Lee等[12]將不同病理分級(jí)的AK與健康正常皮膚的Claudin-1表達(dá)比較分析后發(fā)現(xiàn)，Claudin-1從正常皮膚到重度AK的表達(dá)呈逐漸下降的趨勢，尤其是在表皮不典型的區(qū)域，由此提出Claudin-1可能是AK病理嚴(yán)重程度的一個(gè)有用指標(biāo)。與之一致的是，本研究同樣發(fā)現(xiàn)較癌旁正常表皮，Claudin-1蛋白在AK中的表達(dá)是下調(diào)的，另外我們發(fā)現(xiàn)Claudin-1蛋白在SCC中的陽性表達(dá)要明顯低于AK，由此看出，Claudin-1蛋白的表達(dá)水平與表皮腫瘤病變的嚴(yán)重程度平行，故我們推測Claudin-1的表達(dá)下調(diào)或缺失與SCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可能與細(xì)胞間的緊密結(jié)構(gòu)破壞、極性喪失，細(xì)胞間黏附力下降有關(guān)。

但在我們的實(shí)驗(yàn)中，Claudin-7蛋白無論在正常表皮，還是在AK和SCC中都是呈陰性表達(dá)的，在一定程度上說明Claudin-7與SCC的發(fā)生、發(fā)展無直接聯(lián)系。但有文獻(xiàn)指出，Claudin-7在SCC中的陽性表達(dá)較正常皮膚中高，在癌前期病變中則無明顯表達(dá)，說明它是表皮腫瘤發(fā)生過程中的晚期事件。在Hintsala等[13]的研究中，34例SCC中僅有2例有較強(qiáng)的Claudin-7表達(dá)，42例AK中Claudin-7陰性表達(dá)者較SCC多，該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全符合，可能與收集的樣本量不夠和SCC的分期、類型不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究雖然從組織學(xué)上證實(shí)Claudin-1蛋白在AK和SCC中呈現(xiàn)遞減表達(dá)，推測其與表皮腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)，但細(xì)胞發(fā)生惡性變是一個(gè)多因素、多階段的復(fù)雜過程，一些具體的作用分子機(jī)制如其與細(xì)胞內(nèi)、外其他物質(zhì)間的相互作用關(guān)系、調(diào)節(jié)機(jī)制仍未完全明了，值得我們進(jìn)一步探索。