呂 君 雷淑英

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌(human skin squamous cell carcinoma，SCC)已經(jīng)成為與癌癥相關(guān)的人類死亡的重要原因[1]。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，大約20%人口一生中可能發(fā)生皮膚癌，并且其發(fā)病率每年呈逐漸增高的趨勢(shì)[2]。目前，皮膚癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療[2,3]。對(duì)于晚期、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性SCC的預(yù)后不理想，可能的原因是缺乏有效藥物的治療[4]。因此，開(kāi)發(fā)治療皮膚癌的新型高效化合物具有重大意義。

槲皮黃酮(quercetin，Qu)是一類黃酮類化合物，主要分布在蕨類植物、裸子植物及被子植物中，具有較強(qiáng)的抗炎活性、參與免疫調(diào)節(jié)及具有抗腫瘤的功效[5]；早期已有研究證實(shí)Qu對(duì)輻射誘導(dǎo)的皮膚纖維化具有保護(hù)作用[6]。然而，Qu對(duì)SCC細(xì)胞的增殖活性是否具有抑制作用，尚未見(jiàn)報(bào)道。鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase 2，SphK2)是SCC或其他腫瘤治療的重要藥物靶點(diǎn)[7,8]，SphK2活化可誘導(dǎo)1-磷酸神經(jīng)鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、生存、血管生存及凋亡抵抗[9]。然而，SphK2基因沉默則會(huì)引起S1P前體鞘氨醇和神經(jīng)酰胺的積累，后者會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及分裂周期停滯[10]。因此，本文觀察了Qu對(duì)SCC細(xì)胞活力、增殖及凋亡的影響，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 藥品與試劑 槲皮黃酮、Akt激動(dòng)劑SC79、S1P和JNK抑制劑SP600125均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Annexin V-FITC/PI和CCK8試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Caspase-glot-3/-9活性測(cè)定試劑盒購(gòu)買于美國(guó)Promega公司；BrdU試劑盒購(gòu)自上海Roche Diagnostics公司；兔anti-t-PARP、兔anti-Cle-PARP、兔anti-Cle-PARP、兔anti-Akt、兔anti-p-Akt、兔anti-S6K1、兔anti-p-S6K1、兔anti-JNK1/2、兔anti-p-JNK1/2、兔anti-Sphk2和兔anti-β-actin購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；羊抗兔IgG二抗購(gòu)自上海谷歌生物公司。

1.2 主要儀器 單人超凈臺(tái)(蘇州華新空調(diào)凈化有限公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海醫(yī)用分析儀器廠)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標(biāo)儀(DX540，美國(guó))；SDS-PAGE凝膠電泳儀(型號(hào)DYCZ-24DN，北京六一儀器廠)；成像系統(tǒng)(BIO-RAD，美國(guó))，F(xiàn)ACS-Calibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))。

1.3 A431細(xì)胞培養(yǎng) A431細(xì)胞購(gòu)買于武漢巴菲爾生物有限公司，采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37℃、恒濕，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)至90%左右時(shí)，便可開(kāi)始傳代培養(yǎng)。

1.4 A431細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細(xì)胞24、48、72、96 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10 μL的CCK8試劑的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞吸光度OD值，并計(jì)算A431細(xì)胞相對(duì)活力。計(jì)算公式如下：細(xì)胞相對(duì)活力(%)=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.5 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞接種于6孔板，每孔1000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細(xì)胞9 d后，每3 d更換一次含藥的新鮮培養(yǎng)液；然后對(duì)克隆細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)。

1.6 BrdU ELISA實(shí)驗(yàn) 將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜；Qu(10～200 μg/mL)處理細(xì)胞48 h后，加入BrdU試劑孵育12 h；再采用ELISA試劑盒檢測(cè)BrdU偶聯(lián)的細(xì)胞，并在酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定其吸光度OD值。

1.7 細(xì)胞凋亡及周期檢測(cè) 將對(duì)數(shù)期A431細(xì)胞接種于6孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)夜，然后加入10～200 μg/mL的Qu處理細(xì)胞48 h后，PBS清洗2次，收集細(xì)胞，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNase I染色30 min，流式細(xì)胞儀立即檢測(cè)A431細(xì)胞周期分布情況。另外，收集細(xì)胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞(按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行)，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 Western blotting實(shí)驗(yàn) 收集各組細(xì)胞，每組加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，12000 rpm、4 ℃條件下離心12 min，收集上清。BCA法檢測(cè)上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進(jìn)行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉(zhuǎn)70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將印跡膜放入對(duì)應(yīng)的一抗溶液(稀釋比1∶1000)中，4℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，再把條帶放入盛二抗(稀釋比1∶3000)的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.9 組蛋白DNA水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞，每組加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，12000 rpm、4℃條件下離心12 min，收集上清。然后采用組蛋白DNA ELISA試劑盒分析細(xì)胞凋亡情況，酶標(biāo)儀405 nm處測(cè)定其吸光度OD值。

1.10 Caspase活性試驗(yàn) 收集Qu處理后的各組A431細(xì)胞，采用Caspase-glot-3/-9活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)Caspase-3/9活性，酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定其吸光度值。

1.11 S1P水平檢測(cè) 收集Qu處理后的各組A431細(xì)胞，充分裂解后，離心，收集上清。取20 μg細(xì)胞裂解液與20 mM的D-erythro-Sphingosine(溶于0.1% Triton X-100)、2 mmol/L的ATP和[Y-32P]ATP在37℃條件下反應(yīng)30 min。然后，加入20 mL的HCl終止反應(yīng)；再加入氯仿/甲醇/HCl(100∶200∶1，v/v)，充分振蕩、離心；采用薄層色譜法(溶劑為氯仿/丙酮/甲醇/乙酸/水(10∶4∶3∶2∶1,v/v))分離S1P，采用閃爍計(jì)數(shù)器對(duì)其進(jìn)行定量。

1.12 神經(jīng)酰胺水平檢測(cè) 收集各組細(xì)胞裂解液，采用神經(jīng)酰胺ELISA試劑盒檢測(cè)分析A431細(xì)胞中神經(jīng)酰胺水平，其操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮黃酮抑制A431細(xì)胞活力、周期及增殖 為了觀察槲皮黃酮對(duì)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431生長(zhǎng)的影響，CCK8法檢測(cè)了A431細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮呈時(shí)間和濃度依賴性抑制槲皮黃酮細(xì)胞活力(P<0.05)，見(jiàn)圖1a。進(jìn)一步對(duì)A431細(xì)胞克隆分析發(fā)現(xiàn)，槲皮黃酮處理細(xì)胞9 d后，藥物呈濃度依賴性抑制細(xì)胞克隆(P<0.05)，見(jiàn)圖1b。采用BrdU聯(lián)合ELISA法分析了A431細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮呈濃度依賴性抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，見(jiàn)圖1c。對(duì)A431細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，G1期的A431細(xì)胞數(shù)明顯增多，而S期和G2期細(xì)胞數(shù)明顯減少，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1d。

2.2 槲皮黃酮誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡 槲皮黃酮能夠誘導(dǎo)A431細(xì)胞凋亡，主要表現(xiàn)在槲皮黃酮明顯抑制抗凋亡蛋白t-PARP表達(dá)，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Cle-PARP和Cle-caspase3表達(dá)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2a；同時(shí)，槲皮黃酮明顯增強(qiáng)Caspase-3和Caspase-9活性，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2b。另外，槲皮黃酮還能明顯誘導(dǎo)A431細(xì)胞中組蛋白DNA水平，并顯著增強(qiáng)細(xì)胞凋亡率，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2c、2d。

2.3 槲皮黃酮調(diào)節(jié)A431細(xì)胞中Akt/S6K1和JNK信號(hào)傳導(dǎo) 槲皮黃酮呈濃度依賴性的誘導(dǎo)A431細(xì)胞中神經(jīng)酰胺積累，抑制S1P水平，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3a、3b。進(jìn)一步分析了槲皮黃酮對(duì)A431細(xì)胞中Akt/S6K1和JNK信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮明顯抑制Akt和S6K1的磷酸化水平，明顯誘導(dǎo)JNK1/2蛋白的磷酸化，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3c、3d。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

圖1槲皮黃酮抑制A431細(xì)胞活力、細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.4 槲皮黃酮通過(guò)Akt/S6K1和JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)A431細(xì)胞生長(zhǎng) 為了觀察槲皮黃酮是否通過(guò)Akt/S6K1和JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)A431細(xì)胞生長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)采用了Akt激動(dòng)劑SC79、S1P和JNK抑制劑SP600125與Qu共同干預(yù)細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮能明顯降低細(xì)胞活力，增加細(xì)胞凋亡(P<0.05)，見(jiàn)圖4；另外，SC79、S1P和SP600125與Qu共同處理細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)A431細(xì)胞活力相比于單純Qu組明顯增高，而細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。由此說(shuō)明，槲皮黃酮可通過(guò)Akt/S6K1和JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)A431細(xì)胞生長(zhǎng)。

2.5 槲皮黃酮對(duì)Sphk2信號(hào)的影響 進(jìn)一步檢測(cè)了槲皮黃酮對(duì)Sphk2信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)藥物呈濃度依賴性的抑制Sphk2蛋白表達(dá)(P<0.05)。接著采用SiRNA對(duì)Sphk2基因進(jìn)行過(guò)表達(dá)和沉默發(fā)現(xiàn)，Qu+Sphk2 mimics組細(xì)胞活力相比于單純Qu組明顯增高，細(xì)胞凋亡明顯降低(P<0.05)；Qu+Sphk2 inhibitor組細(xì)胞活力相比于單純Qu組明顯降低，Qu+Sphk2 inhibitor組細(xì)胞凋亡明顯增高(P<0.05)，說(shuō)明Sphk2過(guò)表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)槲皮黃酮對(duì)A431細(xì)胞增殖的抑制作用；另外，Qu+Sphk2 mimics組S1P水平相比于單純Qu組明顯升高，Qu+Sphk2 inhibitor組S1P水平明顯降低(P<0.05)。Qu+Sphk2 mimics組p-Akt和p-S6K1表達(dá)水平相比于單純Qu組升高，而p-JNK1/2表達(dá)水平降低；Qu+Sphk2 inhibitor組p-Akt和p-S6K1表達(dá)水平降低，p-JNK1/2表達(dá)水平升高，說(shuō)明Sphk2過(guò)表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)Qu對(duì)Akt/S6K1信號(hào)的抑制作用及對(duì)JNK信號(hào)的激活作用(圖5)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與Qu組比較，#P<0.05

圖4SC79、S1P和SP600125對(duì)A431細(xì)胞活力和凋亡的影響圖5槲皮黃酮對(duì)Sphk2信號(hào)傳導(dǎo)的影響

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)鱗狀細(xì)胞癌和基底細(xì)胞癌患者組織中Sphk2信號(hào)通路處于高度活化的狀態(tài)，提示該信號(hào)通路參與了皮膚癌的發(fā)病機(jī)制[11]。Sphk2在SCC的發(fā)生中起著重要的致癌功能，其過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)了腫瘤的惡化及化療或放療的耐藥。早期研究報(bào)道在皮膚黑素細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中Sphk2表達(dá)量非常低，而在原代SCC細(xì)胞和細(xì)胞系中Sphk2呈高表達(dá)狀態(tài)[11]，其可成為SCC治療的靶點(diǎn)。

Qu屬于一種藥理活性較強(qiáng)的天然成分，在多種病理反應(yīng)中均起著較好的作用。研究發(fā)現(xiàn)槲皮黃酮不僅對(duì)多種致癌劑、促癌劑有拮抗作用，而且可以抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；并且Qu對(duì)人卵巢癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞等生長(zhǎng)均有較好的抑制作用[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Qu對(duì)A431細(xì)胞具有抗生存、抗增殖和促凋亡的藥理活性，提示Qu可能成為治療SCC的潛在藥物。

Akt/S6K1和JNK信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13,14]，并且在皮膚癌組織中發(fā)現(xiàn)Akt信號(hào)通路異?；罨癑NK信號(hào)傳導(dǎo)的異常失活[15,16]，并且該信號(hào)傳導(dǎo)與多個(gè)關(guān)鍵的癌變行為關(guān)系密切，包括腫瘤細(xì)胞存活、增殖、遷移、細(xì)胞凋亡抵抗、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及血管生成和轉(zhuǎn)化等[13,14]。因此這兩個(gè)通路在皮膚癌的治療和預(yù)防中常被作為靶點(diǎn)[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Qu可以顯著抑制A431細(xì)胞中Akt/S6K1信號(hào)傳導(dǎo)，并激活JNK信號(hào)通路。采用分子靶標(biāo)藥物對(duì)Akt信號(hào)進(jìn)行抑制，在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的抗SCC的作用[18]。Qu對(duì)Akt/S6K1信號(hào)通路進(jìn)行抑制，可能是其誘導(dǎo)SCC細(xì)胞凋亡的原因之一；采用Akt特異性激動(dòng)劑SC79處理細(xì)胞時(shí)，可明顯減弱Qu誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性。SphK2基因沉默能誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺的積累，還會(huì)誘導(dǎo)Akt的去磷酸化[19]。同樣，Qu處理A431細(xì)胞在降低Akt/S6K1信號(hào)傳導(dǎo)時(shí)伴隨著S1P水平的降低，與前期報(bào)道結(jié)果類似[20]。早期研究也表明，Qu可通過(guò)抑制Akt信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而降低乳腺癌細(xì)胞侵襲[21]，也可通過(guò)降低S6K1磷酸化水平抑制增殖表皮癌細(xì)胞生長(zhǎng)[22]；另外，Qu可通過(guò)調(diào)節(jié)JNK信號(hào)活化誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[23]。既往研究已證實(shí)，Akt/S6K1和JNK通路為SphK2的下游信號(hào)[11,24]，本文研究也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)SphK2能部分逆轉(zhuǎn)Qu對(duì)Akt/S6K1信號(hào)的抑制作用及對(duì)JNK信號(hào)的激活作用。

另外，Qu處理A431細(xì)胞可以明顯激活JNK信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)采用JNK信號(hào)通路的特異性抑制劑SP600125與Qu共同處理細(xì)胞時(shí)，降低了Qu對(duì)A431細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。A431細(xì)胞中JNK的激活可能是神經(jīng)酰胺積累所引起的，也可能是Qu抑制SphK2表達(dá)的效應(yīng)分子。已有研究提出神經(jīng)酰胺能誘導(dǎo)JNK信號(hào)通路活化，進(jìn)而促使腫瘤細(xì)胞凋亡；對(duì)JNK信號(hào)通路進(jìn)行抑制可以明顯改善神經(jīng)酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[25]。Qu降低A431細(xì)胞中SphK2表達(dá)可以誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺的產(chǎn)生，促使皮膚癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，Qu可通過(guò)抑制Sphk2信號(hào)通路降低SCC細(xì)胞的增殖活性。